Aussaat und Implantation von einem biosynthetischen Tissue-Engineering trachealen Transplantat in einem Mausmodell
Summary
Transplantat Stenose stellt eine kritische Hindernis Gewebezüchtungen Atemwege Ersatz. Um zellulären Mechanismen, die Stenose zu untersuchen, verwenden wir ein Mausmodell entwickelt trachealen Gewebeersatz mit kernigen Knochenmark mononukleären Zellen (BM-MNC). Hier zeigen wir unsere Protokoll, einschließlich Gerüst Herstellung, BM-MNC Isolierung Transplantat Aussaat und Implantation.
Abstract
Behandlungsmöglichkeiten bei angeborenen oder sekundäre langes Segment trachealen Mängel wurden historisch beschränkt aufgrund einer Unfähigkeit, funktionale Gewebe ersetzen. Gewebetechnik hält großes Versprechen als eine mögliche Lösung mit seiner Fähigkeit, Zellen und Signalmoleküle in eine 3-dimensionale Gerüst zu integrieren. Neuere Arbeiten mit Gewebezüchtungen trachealen Transplantationen (TETGs) hat einige Erfolge gesehen, aber ihre Übersetzung von Transplantat Stenose begrenzt, Transplantat Zusammenbruch und Epithelisierung verzögert. Um die Mechanismen fahren diese Fragen zu untersuchen, haben wir ein Mausmodell für Gewebezüchtungen trachealen Graft Implantation entwickelt. TETGs wurden unter Verwendung Electrospun Polymere Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan (PU) in einer Mischung aus PET und PU (20: 80 Prozent Gewicht) konstruiert. Gerüste wurden dann ausgesät mit Knochenmark mononukleären Zellen isoliert von 6-8 Wochen-alte C57BL/6 Mäusen durch gradient zentrifugieren. 10 Millionen Zellen pro Graft waren auf das Lumen des Gerüstes ausgesät und erlaubt über Nacht vor der Implantation zwischen dem dritten und siebten trachealen Ringe auszubrüten. Diese Transplantate konnten die Ergebnisse der Stenose zu rekapitulieren und Epithelisierung verzögert, wie histologische Analyse und Mangel an Keratin 5 und Keratin 14 basalen Epithelzellen auf Immunfluoreszenz zeigen. Dieses Modell dient als Instrument für die Untersuchung von zellulärer und molekularer Mechanismen Host Umgestaltung beteiligt.
Introduction
Long-Segment trachealen Mängel können als seltene angeborene Erkrankungen wie komplette trachealen Ringe und trachealen Agenesie sowie Trauma, Bösartigkeit und Infektion darstellen. Bei Überschreitung von 6 cm bei Erwachsenen oder 30 % der trachealen Länge bei Kindern können diese Mängel durch chirurgische Rekonstruktion behandelt werden. Versuche, die Atemwege mit Eigengewebe, cadaveric Transplantationen und künstliche Konstrukte zu ersetzen haben chronische Infektion, Granulation, mechanisches Versagen und Stenose geplagt.
Gewebezüchtungen trachealen Transplantate (TETGs) können möglicherweise diese Probleme anzugehen, unter Vermeidung der Notwendigkeit einer lebenslangen Immunsuppression. In den letzten zehn Jahren wurden TETGs im Tiermodell getestet und klinisch eingesetzt, in seltenen Fällen von compassionate-Use1,2,3. In sowohl großen als auch klinische Untersuchungen an Tieren, postoperative Erholung von Gewebezüchtungen Atemwege Ersatz benötigt zahlreiche Interventionen zur Bekämpfung Stenose (definiert als > 50 % luminalen Verengung) und Durchgängigkeit der Atemwege zu erhalten. Zusätzliche TETG Arbeit hat versucht, diese Stenose durch Bewertung der Rolle der Zelle Aussaat Wahl, Vaskularisierung und Gerüst Design zu reduzieren. Zelle seeding Entscheidungen und Gerüst Design zur Wiederherstellung der native Luftröhre Struktur/Funktion haben sich vor allem auf respiratorische Epithelzellen und Chondrozyten auf verschiedenen decellularized, resorbierbaren und nicht resorbierbaren Gerüsten ausgesät konzentriert. Wie Vaskularisierung wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Stenose spielt, haben andere Gruppen fokussiert auf die Optimierung in Vitro oder heterotopisch Modelle Revaskularisation oder Neoangiogenese4zu beschleunigen. Dennoch bleibt es eine Herausforderung, erfolgreiche Vaskularisierung und gleichzeitig mechanisch kompetent und funktionelle TETG zu erreichen. Trotz der jüngsten Fortschritte bleibt die Minimierung der Stenose eine kritische Hindernis für klinische Übersetzung.
Um diese histopathologische Reaktion auf TETG Implantation in Vivozu untersuchen, haben wir eine Schafe Gewebezüchtungen trachealen Ersatz-Modell entwickelt. Das Transplantat bestand aus einer gemischten Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan (PU)-Electrospun-Gerüst mit dem Knochenmark stammenden mononukleären Zellen (BM-MNU) ausgesät. In dieser kleinen Kohorte haben wir bewiesen, dass gesetzte autologe BM-MNCs Re Epithelisierung beschleunigt und Stenose5 verzögert. Aussaat mit autologen BM-MNCs verbessert überleben, bleibt unklar jedoch der zelluläre Mechanismus durch den BM-MNCs die Bildung von funktionalen Neotissue modulieren.
Untersuchung auf der zellulären Ebene erforderlichen Entwicklung ein Mausmodell des Gewebes entwickelt trachealen Ersatz. Ähnlich wie bei den Schafen Studie, wir nutzten ein PET:PU Electrospun Gerüst ausgesät mit BM-MNCs. in Übereinstimmung mit den Schafen Modell TETG Stenose entwickelt im Laufe der ersten zwei Wochen nach Implantation1,2,3 ,5. Dies suggeriert, dass das Mausmodell die Pathologie zuvor beobachtet es uns ermöglicht, weiter die zellulären Mechanismen, die Atemwege Stenose Verhören zusammengefaßt.
In diesem Bericht beschreiben wir unser Protokoll für Tissue Engineering trachealen Ersatz im Mausmodell einschließlich Gerüst Herstellung, BM-MNC Isolierung Transplantat Aussaat und Implantation (Abbildung 1, Abbildung 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Entwicklung von einem Maus-Modell für Gewebezüchtungen Tracheas ist wesentlich für das Verständnis der Faktoren, die klinische Übersetzung von der TETGs begrenzt haben; nämlich Transplantat Zusammenbruch, Stenose und verzögerte Epithelisierung4. Ein paar Faktoren, die zu diesen Einschränkungen zählen Transplantat Materialauswahl, den Herstellungsprozess, Gerüst Design und Zelle Aussaat Protokolle. Dieses Modell ermöglicht eine schnellere Auswertung dieser Faktoren Verständnis der zellu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir würden gerne Robert Strouse und die Forschung Information Solutions & Innovationen Division bei Nationwide Children Hospital für ihre Unterstützung in Grafik-Design zu erkennen. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der NIH (NHLBI K08HL138460) unterstützt.
Materials
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
- Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
- Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
- Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
- Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology – Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
- Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology – Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
- Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
- Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).
