Ensemencement et Implantation d’un greffon biosynthétique de trachéale tissulaire dans un modèle murin
Summary
Sténose de la greffe constitue un obstacle critique en remplacement de tissu conçu des voies respiratoires. Afin d’étudier les mécanismes cellulaires qui sous‑tendent la sténose, nous utilisons un modèle murin de remplacement trachéale tissu machiné avec ensemencé la moelle osseuse des cellules mononucléaires (BM-MNC). Ici, nous détaillons notre protocole, y compris la fabrication d’échafaudages, BM-MNC isolement, semis de la greffe et l’implantation.
Abstract
Options de traitement pour les défauts trachéale segment long congénitale ou secondaire ont historiquement été limitées en raison de l’incapacité de remplacer des tissus fonctionnels. Génie tissulaire est très prometteur comme une solution possible, grâce à sa capacité à intégrer les cellules et molécules de signalisation dans un échafaudage en 3 dimensions. Des travaux récents avec tissu machiné trachéale greffes (TETGs) a connu quelques succès, mais leur traduction a été limitée par une sténose greffon, effondrement de greffe et retardé l’épithélialisation. Afin d’étudier les mécanismes conduisant à ces questions, nous avons développé un modèle murin pour l’implantation de prothèse trachéale tissu machiné. TETGs ont été construits à l’aide d’électrofilées polymères en polyéthylène téréphtalate (PET) et polyuréthane (PU) dans un mélange d’animal de compagnie et d’unité centrale (20 80 pour cent de poids). Les échafaudages ont été ensemencées puis à l’aide de la moelle osseuse des cellules mononucléaires isolés de 6 à 8 semaines-vieilles souris C57BL/6 par centrifugation en gradient. 10 millions de cellules par greffon ont été ensemencées dans le lumen de l’échafaudage et incubés pendant la nuit avant l’implantation entre les troisième et septième trachées anneaux. Ces greffes ont réussi à récapituler les résultats de la sténose et retardé l’épithélialisation tel que démontré par l’analyse histologique et le manque de kératine 5 et 14 de la kératine les cellules épithéliales basales sur immunofluorescence. Ce modèle servira comme outil pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’hôte de remodelage.
Introduction
Long segment trachéales congénitales peuvent présenter comme des affections congénitales rares tels que les anneaux trachéaux complets et l’agénésie trachéale, ainsi qu’un traumatisme, malignité et l’infection. Cas de dépassement de 6 cm en adultes, soit 30 % de la longueur trachéale chez les enfants, ces défauts ne peuvent être traités par reconstruction chirurgicale. Tentatives de remplacer les voies respiratoires par tissus autologues, greffes cadavériques et des constructions artificielles ont été en proie à une infection chronique, granulation, défaillance mécanique et une sténose.
Tissu machiné trachéales greffes (TETGs) peuvent potentiellement résoudre ces problèmes tout en évitant la nécessité d’une immunosuppression toute la vie. Au cours de la dernière décennie, TETGs ont été testées dans des modèles animaux et utilisés cliniquement dans de rares cas d’un usage compassionnel1,2,3. Dans les cliniques et les grandes études animales, convalescence postopératoire de tissu conçu des voies aériennes remplacement requis nombreuses interventions pour sténose combattre (définie comme > 50 % de rétrécissement Luminale) et maintenir la perméabilité des voies aériennes. Des travaux supplémentaires de TETG a cherché à réduire cette sténose par le biais de l’évaluation du rôle de cellule ensemencement de choix, de vascularisation et de design de l’échafaudage. Cellule semis choix et conception d’échafaudage visant à restaurer la trachée native structure/fonction ont principalement portés sur les cellules épithéliales respiratoires et chondrocytes ensemencés sur des échafaudages résorbables, non résorbables et decellularise diverses. Comme susceptibles de vascularisation joue un rôle majeur dans le développement de la sténose, autres groupes ont mis l’accent sur l’optimisation in vitro ou modèles hétérotopiques pour accélérer la revascularisation ou néoangiogénèse4. Réalisation de vascularisation avec succès tout en conservant un TETG mécaniquement compétent et fonctionnel reste néanmoins un défi. Malgré des progrès récents, minimisant la sténose demeure un obstacle critique traduction clinique.
Pour étudier cette réponse histopathologique à TETG implantation in vivo, nous développé un modèle ovin de tissu conçu remplacement trachéale. La prothèse était composée d’un mélange de polyéthylène téréphtalate (PET) et polyuréthane échafaudage d’électrofilées (PU), ensemencé avec la moelle osseuse des cellules mononucléaires (BM-PTM). Dans cette petite cohorte, nous avons démontré qu’ensemencés autologue BM-PTM accéléré réépithélialisation et retardé la sténose5. Bien que l’ensemencement avec autologue BM-PTM amélioré la survie, le mécanisme cellulaire par lequel BM-PTM module la formation de neotissue fonctionnelle ne sait pas.
Enquête sur le développement nécessaire niveau cellulaire d’un modèle murin de tissu conçu remplacement trachéale. Semblable à l’étude de l’espèce ovine, nous avons utilisé un échafaudage d’électrofilées PET:PU ensemencé avec BM-PTM. en accord avec le modèle ovin, sténose TETG développé au cours des deux premières semaines suivant l’implantation1,2,3 ,,5. Cela suggère que le modèle murin récapitulé la pathologie observée plus tôt, ce qui nous permet d’interroger davantage les mécanismes cellulaires qui sous-tendent la sténose des voies respiratoires.
Dans ce rapport, nous détaillons notre protocole pour tissulaire génétiquement modifié, remplacement trachéale chez la souris y compris fabrication d’échafaudage, isolation BM-MNC, greffon ensemencement et l’implantation (Figure 1, Figure 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Développement d’un modèle de souris de trachées de tissu conçu est essentiel dans la compréhension des facteurs qui ont limité la traduction clinique des TETGs ; nommément greffe s’effondrer, sténose et retardé l’épithélialisation4. Quelques-uns des facteurs qui contribuent à ces limitations incluent la sélection du greffon, le procédé de fabrication, conception d’échafaudage et cellule ensemencement des protocoles. Ce modèle permet une évaluation plus rapide de ces fact…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous aimerions remercier Robert Strouse et la recherche Information Solutions division d’Innovations à l’hôpital de l’enfant dans tout le pays pour leur soutien dans la conception graphique. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (NHLBI K08HL138460).
Materials
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
- Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
- Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
- Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
- Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology – Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
- Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology – Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
- Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
- Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).
