Bösartig und B-Zellen nicht bösartig aus Lck:eGFP Zebrafisch zu isolieren
Summary
Transgenen Lck:eGFP Zebrafisch express GFP hoch in T-Lymphozyten und wurden verwendet, um die T-Zell-Entwicklung und akute lymphoblastische Leukämie zu studieren. Diese Linie dient zur Studie B-Zellen, die Lck auf den unteren Ebenen zum Ausdruck bringen. Dieses Protokoll beschreibt Reinigung von malignen und nicht-malignen B-Zellen aus Lck:eGFP Zebrafisch.
Abstract
Zebrafisch (Danio Rerio) sind ein leistungsfähiges Modell Lymphozyten Entwicklung zu studieren. Wie bei Säugetieren besitzen D. Rerio einen adaptiven Immunsystems, die B- und T-Lymphozyten enthält. Studien der Zebrafisch Lymphopoiese sind schwierig, weil Antikörper D. Rerio Zelle Oberflächenmarker zu erkennen in der Regel nicht verfügbar sind, erschweren, Isolierung und Charakterisierung von verschiedenen Lymphozyten Bevölkerungsgruppen, einschließlich B-Linie Zellen. Transgene Linien mit Abstammung-spezifische Fluorophor Ausdruck werden häufig verwendet, um diese Herausforderung zu umgehen. Die transgenen Lck:eGFP -Linie wurde verwendet, um D. Rerio T-Zell-Entwicklung zu studieren und auch für Modell T Zelle Entwicklung und akute lymphoblastische Leukämie (T-ALL) verwendet worden. Obwohl Lck:eGFP Fisch allgemein verwendet wurden, um die T-Linie zu analysieren, wurden sie nicht zur B-Zellen zu studieren. Vor kurzem entdeckten wir, dass viele Zebrafisch B Zellen Lck, auch zum Ausdruck bringen, wenn auch auf einem niedrigeren Niveau. Infolgedessen express Lck:eGFP B-Zellen ebenfalls niedrige Konzentrationen von GFP. Ausgehend von dieser Feststellung, entwickelten wir ein Protokoll, um die Zellen der B-Linie von Lck:eGFP Zebrafisch, reinigen, das wir hier berichten. Unsere Methode beschreibt, wie Sie einen Leuchtstoff-activated Cell Sorter (FACS) B-Zellen aus Lck:eGFP Fisch oder verwandte Linien, wie Doppel-transgenen Rag2:hMYCzu reinigen zu nutzen; LCK:eGFP Fisch. In diesen Zeilen, B-Zellen, insbesondere unreife B-Zellen, ausdrückliche GFP auf niedrig aber nachweisbar Ebenen, so dass sie zu unterscheiden von T-Zellen, die GFP hoch zum Ausdruck zu bringen. B-Zellen können von Knochenmark, Thymus, Milz, Blut oder anderen Geweben isoliert werden. Dieses Protokoll bietet eine neue Methode um D. Rerio B-Zellen, Studien zu Themen wie Entwicklung von B-Zellen und B-Lymphozyten maligne Erkrankungen konzentriert zu reinigen.
Introduction
Zebrafisch bieten leistungsfähige Attribute, z. B. genetischen Manipulierbarkeit, hohe Fruchtbarkeit, optische Transparenz und schnelle Entwicklung, die studiert vertebrate Entwicklung mit gentechnische Ansätze ermöglichen. Diese Vorteile zusammen mit der Gemeinsamkeiten der teleost und Säugetieren Hämatopoese machen D. Rerio ideal für in-vivo-Analysen von Lymphopoiese und Lymphozyten Funktion, von ihren ersten Auftritt in Larven im gesamten Erwachsenenalter. Blut-Entwicklung im Zebrafisch stützt sich auf gut erhaltenen genetische Prozesse, die mit Säugetieren geteilt werden, und diese erstrecken sich auf das adaptive Immunsystem. Darüber hinaus sind molekulare Mechanismen für lymphoide Entwicklung bemerkenswert zwischen Zebrafisch und Säugetiere1konserviert.
In den letzten 2 Jahrzehnten transgenen D. Rerio Linien dieses Label bestimmte Blut Linien und mutierte Linien einen Mangel an diesen Linien2,3,4,5erstellt wurden. Eine davon, die Lck:eGFP transgene Linie verwendet den Zebrafisch Lymphozyten Protein Tyrosin-Kinase (Lck) Projektträger GFP Ausdruck6fahren. Dieses Gen, das von T-Linie Vorstufen und Reifen T-Lymphozyten hoch zum Ausdruck kommt, kann in-vivo Verfolgung der Zebrafischembryonen T-Zell-Entwicklung und ex-Vivo-Reinigung der T-Linie Zellen durch FACS-7. Früher wir diese Linie in einem vorwärts-genetische ENU Mutagenese Bildschirm Keimbahn Mutanten anfällig für T-ALL zu identifizieren und somatisch erworbenen genetischen Veranstaltungen im Zusammenhang mit T-Zell Onkogenese8,9zu studieren.
Vor kurzem hat unser Labor das Dienstprogramm Lck:eGFP Zebrafisch weiter ausgebaut. In Doppel-transgenen Rag2:hMYC (menschliches MYC), Lck:eGFP D. Rerio , die bekanntermaßen T-ALL 10, entwickeln wir entdeckt, dass B-Linie alle11auch auftreten. Im Gegensatz zu T-ALL in diesem Modell hell durch hohe GFP Expression fluoreszieren, B-ALL sind schwach-Leuchtstofflampen aufgrund des niedrigen GFP, so dass Fische mit B-ALL zu unterscheiden grob mit T-ALL mit Fluoreszenz-Mikroskopie. Diese differentielle GFP Expression ermöglicht auch die Trennung der GFPlo B-alle Zellen von GFPHallo T-ALL-Zellen mittels FACS11. Niedrige Lck Ausdruck ist übrigens nicht als menschliche B-ALL auch express niedrige Konzentrationen von LCK11,12Zebrafisch B-ALL, einzigartig. Ebenso normale Zellen der B-Linie von D. Rerio, Mäusen und Menschen auch niedrige Konzentrationen von Lckausdrücken /GLK/LCKmit unreifen B-Zellen mit den höchsten Ausdruck11,13. Auf einer Basis pro Zelle express B-Linie Zellen LckeGFP Zebrafisch oder Derivat Zeilen 1-10 % soviel GFP als T-Lymphozyten. Diese GFPlo ausdrückliche Merkmal B-Zell-mRNAs wie pax5, cd79b, Blnk, Btk, Ighm, Ighzund andere Zellen, und kann aus Knochenmark, Thymus, Milz oder peripheren gereinigt werden Blut-11. Daher isoliert beide B – und T-Linie Zellen aus LckeGFP Zebrafisch und im Falle von rag2hMYC, LckeGFP Tiere, B – und T-alle Zellen sowie11.
Hier präsentieren wir unsere Protokoll effizient FACS reinigen nicht-malignen B-Zellen aus Lck:eGFP Zebrafisch und nicht-bösartigen oder malignen B-Zellen der rag2hMYC; LCK:eGFP Fisch, mit verschiedenen Quelle Gewebe. Solche Zellen können ebenso durch Durchflusszytometrie ohne FACS Isolierung, quantifiziert werden, falls gewünscht. Entdeckung der niedrigen Lck Ausdruck- und folglich niedrigen GFP Expression-durch B Zellen öffnet neue Türen der experimentellen Möglichkeiten für LckeGFP Zebrafisch, wie z. B. in Vivo B Zellen-Studien. So hat dieser transgenen Linie, erstmals im Jahr 2004 berichtet neues Leben wie wir es um neue Erkenntnisse über Zebrafisch adaptive Immunität aufzulesen nutzen wollen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir entwickelt und bieten ein Protokoll zur B-Zellen aus Lck:eGFP transgenen Zebrafisch, isolieren das Hinzufügen anderer D. Rerio Modelle mit B-Linie Etiketten3,4. Etwas überraschend ging die Identifizierung der GFPlo B Zellen in dieser Zeile seit seiner Beschreibung im Jahr 2004 unbemerkt. In der Regel Lck gilt als T-Zell-spezifische6, aber neuere Studien gefunden, unerwartete Lck Ausdruck…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten danken Megan Malone-Perez für Zebrafisch Pflege und OUHSC Flow Cytometry Kern. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von Hyundai Hope auf Rädern, die Oklahoma Center for the Advancement of Science und Technology (HRP-067), ein NIH/NIGMS INBRE Pilotprojekt Award (P20 GM103447). JKF hält die E.L & Thelma Gaylord-Stiftungsprofessur in Pädiatrische Hämatologie-Onkologie an der Children Hospital Foundation.
Materials
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |
References
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