İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar
Summary
Burada, bir Gelişmiş Maya bir melez Protokolü faiz bir insan DNA bölgesine bağlayabilirsiniz transkripsiyon faktörleri (TFs) tanımlamak için eleme mevcut. Bu yöntem bağlama sorguya çekebiliriz yüksek üretilen iş tarama ardışık düzen kullanan > 1000 TFs tek denemede.
Abstract
Her insan gen düzenleyen transkripsiyon faktörleri (TFs) kümesi tanımlayan çok sayıda deneysel ve hesaplamalı yaklaşımlar entegre gerektiren bir iştir. Böyle bir yöntem hangi Hofstede TFs ve DNA bölgeleri reporter genler kullanarak Maya çekirdeği ortamda sınanır Maya bir hibrid (Y1H) tahlil olduğunu. Y1H deneyleri iki bileşeni içerir: bir ‘DNA-yem’ (e.g., organizatör, arttırıcılar, susturucu, vb) ve bir ‘TF-hangi muhabir gen harekete geçirmek için ekranlı av,’. Y1H ekranlar yerine getirmek için kullanılan en yayımlanmış protokolleri TF-av kitaplıkları veya dizileri DNA-yem maya suşları dönüşüm üzerinde temel alır. Burada, biz bir ardışık düzen tanımlamak, gelişmiş Y1H denilen (eY1H) deneyleri, nerede TF-DNA etkileşimleri DNA-yem suşları dizilmiş bir koleksiyonundan bir yüksek yoğunluklu kullanarak TF-av suşlarının çiftleşme tarafından sorguya bir 1,536 tarama sağlar (HDA) robot platformu Koloni biçimi. Bu işlem hacmi dramatik bir artış sağlar (karşı 60 DNA-yem dizileri > 1000 TFs araştırmacı başına iki hafta alır) ve tekrarlanabilirlik. Biz insan organizatörü dizileri 1,086 insan TFs yanı sıra ekranlar ve onları giderme sırasında ortaya çıkabilecek sorunları örnekleri bir dizi karşı test ederek beklenen sonuçları farklı türleri gösterilmektedir.
Introduction
Biyomedikal alanında merkezi bir sorun hangi tarafından her insan gen düzenlenmiştir mekanizmaları belirliyor. Transkripsiyon gen ifade düzeyleri kontrol ilk adım, ve bu her gen özgüdür transkripsiyon faktörleri (TFs) kümesi tarafından düzenlenir. Verilen bu insan için kodlamak > her gen ifadesi kontrol TFs eksiksiz kümesi tanımlayan 1.500 TFs1,2, kalır açık bir meydan okuma.
İki tür yöntemi TF-DNA etkileşimleri eşlemek için kullanılan: TF merkezli ve DNA merkezli yöntemleri3 (resim 1A). TF merkezli yöntemlerinde, bağlama genomik DNA bölgeleri veya onun DNA bağlama özgüllük belirlemek için bir TF ilgi probed. Bu yöntemler yüksek üretilen iş sıralama, protein bağlayıcı microarrays ve SELEX4,5,6takip kromatin immunoprecipitation (ChIP) içerir. DNA merkezli yöntemlerinde, DNA dizisi bağlamak TFs kümesini belirlemek için bir DNA dizisi ilgi probed. Bu yöntemlerden en yaygın olarak uygulanan Maya bir hibrid (Y1H) deneyleri, TFs ve DNA arasında hangi etkileşimleri bölgeleri reporter genler7,8,9kullanarak Maya çekirdeği ortamda test edilir var.
Y1H deneyleri iki bileşeni içerir: bir ‘DNA-yem’ (örneğin, organizatör, arttırıcılar, susturucu, vb) ve bir ‘TF-hangi muhabir gen harekete geçirmek9,10 için (Şekil 1B) ekranlı av,’. DNA-yem akıntıya karşı klonlanmış iki muhabir gen (LacZ ve HIS3) ve her iki DNA-bait::reporter yapıları chromatinized ‘DNA-yem suşları.’ oluşturmak için Maya genom entegre edilmiştir TF-av, harekete geçirmek etki alanına Gal4 TF, Maya (AD) erimiş bir TF ifade eder bir plazmid kodlanmış TF-DNA etkileşimleri için balık için DNA-yem gerilim girmiştir. TF-av DNA-yem sırasına bağlanır, TF-av içinde mevcut reklam her iki gazeteci genleri harekete geçirmek yol açacaktır. Sonuç olarak, olumlu etkileşim içeren hücreler büyüme histidin eksik yanı sıra bir rekabetçi inhibitörü, 3-Amino-1,2,4-triazole (3-AT), üstesinden plakaları için seçilen ve X-gal huzurunda mavi koloniler olarak görüntülenir. Çünkü güçlü Maya Gal4 AD kullanıldığında, Y1H deneyleri ilgili transkripsiyon aktivatörleri yanı sıra repressors etkileşimleri algılayabilir. Ayrıca, verilen bu TF-dualarının güçlü Maya organizatörü (ADH1) ifade edilir, etkileşimleri için bile çip11,12‘ algılamak için zorlu düşük endojen ifade seviyesine sahip TFs algılanabilir.
Y1H deneyleri gerçekleştirmek için en yayımlanmış protokolleri seçimi, koloni tespit ve etkileşen TF tanımlamak için sıralama veya havuza alınmış TF-av kitaplıkları dönüştürerek Maya DNA-yem suşları TF-dualarının tanıtımı üzerinde temel alan bireysel dönüşüm8,9klonlar. Bunlar araştırmacı test edilebilir DNA dizileri sayısını sınırlama zaman alıcı kurallarıdır. Y1H deneyleri, adı verilen bir son gelişme Y1H Gelişmiş (eY1H), önemli ölçüde artmıştır tarama işlem hacmi Maya DNA-yem suşları maya suşları topluluğu ile her bir farklı ifade dostum için bir yüksek yoğunluklu dizi (HDA) robot platformu kullanarak TF-av10,13 (Şekil 1 c). Bu ekranlar bir 1.536 koloni biçimine izin en insan TFs sadece üç tabak kullanarak quadruplicate test etmek için istihdam. TF-DNA etkileşimleri ikili bir şekilde test edilir göz önüne alındığında, daha fazla, bu yaklaşım etkileşimler DNA-yemler (örneğin iki kodlamayan tek nükleotid çeşitleri) arasında farklı TFs arasında karşılaştırmak için olanak tanır veya TF türevleri11,12 ,14.
EY1H deneyleri kullanarak, biz en büyük insan ve Caenorhabditis elegans DNA merkezli TF-DNA etkileşimleri ağlar-Tarih belirlendi. Özellikle, 246 insan gelişimsel arttırıcılar ve 283 TFs122,230 Hofstede belirledik. Ayrıca, biz eY1H deneyleri 109 tek nükleotid kodlamayan değişik gelişimsel malformasyonu, kanser ve nörolojik bozukluklar gibi genetik hastalıklar ile ilişkili değişmiş TF bağlama ortaya çıkarmak için istihdam. Daha yakın zamanlarda, eY1H 21,714 etkileşimleri 2,576 C. elegans gen rehberleri ile 366 TFs11arasında oluşan bir ağ betimlemek için kullanılır. Bu ağ, C. elegans TFs onlarca işlevsel rolü ortaya çıkarmak için bir vesile oldu.
Protokol DNA-yem lekeleri oluşturmak ve arka plan muhabir etkinliği düzeylerini değerlendirmek için başka bir yerde15,16,17bildirdi. Burada, herhangi bir insan genomik DNA bölge 1,086 insan TFs bir dizi karşı ekran için kullanılan bir eY1H boru hattı açıklayın. Bir kez bir Maya DNA-yem zorlanma oluşturulur ve bir TF-av dizi karşılık gelen tabak fark edilir, tüm protokol iki haftada (Tablo 1) gerçekleştirilebilir. Daha da önemlisi, böylece tek bir araştırmacı 60 DNA-yem dizileri aynı anda ekran protokol parallelized. Protokol göstermek için iki sitokin gen CCL15 ve IL17F ve ekranlı. Buna ek olarak, eY1H deneyleri ve onları giderme işlemi sırasında ortaya çıkabilecek sorunları türlerini göstermek için başarısız ekranlar sonuç göster.
Protocol
Representative Results
Discussion
Robot eY1H çiftleşme tarama yaklaşımı büyük ölçüde burada açıklanan faiz önceki Kütüphane tarama için karşılaştırıldığında, ya da dönüşüm üzerinde göre dizilmiş tarama yaklaşımlar bir DNA bölgesine bağlamak TFs kümesini tanımlamak için daha fazla işlem hacmi artar. Ayrıca, tüm dört kolonileri için olumlu TF test edilmiş ve etkileşimleri yüzde 90’ını aynı Maya DNA-yem zorlanma10 bağımsız bir ekranda tekrar test etkileşimleri % 90’ı tespit deneyl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri [J.I.F.B. için R35-GM128625] tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
| Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
| Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
| Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
| D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
| Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
| edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
| Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
| Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
| Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
| L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
| Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
| Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
| PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
| Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
| RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
| Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
| Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
| Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
| Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |
References
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
- Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
- Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
- Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
- Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
- Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
- Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
- Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
- Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
- Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
- Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
- Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
- Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
- Burdo, B., et al. The Maize TFome–development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).
