Summary

一种新的坏死性肠结肠炎人上皮肠素模型

Published: April 10, 2019
doi:

Summary

肠类正在成为人类疾病研究的新模式。该协议描述了如何模拟人坏死性小肠结肠炎的肠素模型使用脂多糖 (LPS) 治疗从新生儿组织产生的肠内化合物。收集的肠素显示炎症变化类似于那些在人类坏死性小肠结肠炎。

Abstract

坏死性小肠结肠炎 (NEC) 是新生儿的一种毁灭性疾病。它的特点是人类肠道上皮的多种病理生理改变, 导致肠道通透性增加, 恢复受损, 细胞死亡增加。虽然 NEC 有许多动物模型, 但对伤害的反应和治疗干预可能在物种之间差异很大。此外, 直接在人体, 特别是儿童身上研究疾病病理生理学或新型治疗药物在伦理上具有挑战性。因此, 开发一种利用人体组织的新的 NEC 模型是非常可取的。肠内化合物是从肠道上皮细胞中提取的三维有机体。它们是研究复杂生理相互作用、细胞信号转导和宿主病原体防御的理想选择。在这份手稿中, 我们描述了一个方案, 培养人类肠内化合物后, 从患者的肠道切除分离。隐孢子细胞在培养基中培养, 培养基中含有生长因子, 鼓励分化为人体肠道上皮所固有的各种细胞类型。这些细胞生长在一种合成的胶原蛋白混合物中, 作为支架, 模仿细胞外基底膜。因此, 肠体发育到顶端-基外侧极性。在培养基中联合使用脂多糖 (LPS) 会引起肠内的炎症反应, 导致组织学、遗传和蛋白质表达的改变, 类似于人类 NEC 中的变化。使用人体组织的 NEC 实验模型可以为人体试验前的药物和治疗测试提供更准确的平台, 因为我们努力确定这种疾病的治愈方法。

Introduction

人肠内化合物是一种从人体肠道组织样本的肠道隐窝中分离出的干细胞产生的体外三维培养系统。2007年, 汉斯·克莱弗斯等人在小鼠1的小肠隐窝中发现 lgr5 + 干细胞后, 开创了这一突破性模型。他们的工作为建立多种细胞类型的体外肠道上皮培养奠定了基础, 这些细胞可以在没有明显遗传或生理变化的情况下被传代2。自这一发现以来, 肠体已被用作研究正常消化生理学的新模型, 以及炎症性肠病、宿主病原体相互作用和再生医学2等肠道疾病的病理生理学.

与替代技术相比, 使用肠内生物作为肠道病理生理学研究的体外模型有几个优势。近几十年来, 动物模型和不朽的肠道癌症衍生细胞系被用于肠道生理研究3,4,5。单细胞培养并不代表正常肠道上皮细胞类型的多样性, 因此在蛋白质表达、信号和病原诱发疾病方面缺乏细胞对细胞的交叉对话和节段特异性 6.肠内细胞中的干细胞分化为主要的上皮细胞类型, 如肠细胞、Paneth 细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞等3种。它们表现出极性, 执行上皮运输功能, 并允许肠道部分特异性6。由于肠体可以重述人类肠道上皮的多种细胞类型, 他们能够克服这种公认的局限性的癌症细胞为基础的系统。随着时间的推移, 细胞系的衍生物被克隆和进化, 以显示出更大的多样性, 蛋白质表达和定位3。相反, 肠内化合物可以在没有显著遗传或生理变化的情况下进行传代2。尽管有许多 nec 的动物模型, 但对伤害的反应和治疗干预可能在物种之间差异很大。由于这些限制, 从动物模型中提取的疗法在人体试验中测试的时间有90% 的时间都在失败, 因为毒性或疗效的差异3。肠素作为有前途的临床前模型, 可以克服这些缺陷, 导致更好地了解复杂的肠道病理生理学, 从而更成功和更具成本效益的治疗创新。最近还有证据表明, 肠体产生的组织年龄在生物学上仍然重要 7.这是一个特别重要的细节, 我们的模型, 因为肠素是由新生儿组织产生, 从而保持生理相关性的 nec 患者。

肠类固醇作为人类疾病的模型的效用继续扩大, 希望找到治疗严重和普遍的疾病的方法。坏死性小肠结肠炎 (NEC) 是一种破坏性的新生儿肠道疾病, 其特点是肠道坏死, 经常导致肠壁穿孔、败血症和死亡8。由于 NEC 的复杂和多因素病理生理学, 该疾病的确切机制尚未得到充分阐明;然而, 肠道通透性的增加显然与疾病过程牵连8。鉴于 NEC 和潜在治疗药物的研究在人类主体, 特别是儿童的伦理上具有挑战性, 因此非常希望使用使用人类新生儿组织的 NEC 的生物学相关肠样模型。到目前为止, 肠体在 NEC 的研究中的作用有限。该方案描述了从人体肠道组织样本中提取的肠素作为一种新的体外模型来研究坏死性小肠结肠炎的方法。

Protocol

获得机构审查委员会批准 (IRB #2013-15152), 以便从伊利诺伊州芝加哥安和罗伯特 H. Lurie 儿童医院接受肠道切除的病人收集组织样本。所有议定书都是按照机构和国家人类福利准则和条例执行的。在所有情况下, 在采集样本之前都需要得到父母的书面知情同意。 1. 试剂制备 为整个组织收集准备培养基库存溶液: Dulbecco 改性鹰培养基 (DMEM) 的1升、胎儿牛血清 (FBS) 的110毫升、?…

Representative Results

电镀后, 新鲜隔离的肠道墓穴立即显示为细长的棒。在数小时内, 肠体将出现圆形外观 (图 1a)。在接下来的几天里, 肠体将开始形成球体, 如图 1b 所示。发芽应发生在5-10 之间 (图 1c), 肠体收集应在该时间发生。 生长中的肠?…

Discussion

这种新型的体外人体肠肠素模型可作为坏死性小肠结肠炎 (NEC) 肠道屏障功能障碍的研究方法。这里介绍的肠内处理方法是根据 Misty good 博士、Michael Helmrath 博士和 Jason Wertheim博士 101112 的前一部工作改编的。

有关整个组织收集和密码隔离时间的详细信息是本协议中的关键步骤。手术切除时必须立即收?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了国家糖尿病、消化和肾脏疾病赠款研究所 (K08DK106450) 和美国儿科外科协会 jay Grosfeld 奖对 c. j. h. 的支持。

Materials

4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

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Cite This Article
Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

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