Intramucosal inoculación de células escamosas células en ratones para perfilar inmune del Tumor y tratamiento evaluación de respuesta
Summary
Aquí presentamos un método reproducible para el desarrollo de un modelo Murino ortotópico de cabeza y cuello de células escamosas. Tumores demuestran clínicamente relevantes características histopatológicas de la enfermedad, como necrosis, pobre diferenciación, metástasis ganglios, infiltración inmune. Ratones con tumores síntomas clínicamente relevantes incluyendo disfagia, desplazamiento de la mandíbula y pérdida de peso.
Abstract
Carcinoma de célula de squamous de la cabeza y cuello (HNSCC) es una enfermedad debilitante y mortal con una alta prevalencia de repetición y fracaso del tratamiento. Para desarrollar mejores estrategias terapéuticas, comprensión tumor microambiental los factores que contribuyen a la resistencia al tratamiento es importante. Un impedimento importante para entender mecanismos de la enfermedad y mejorar la terapia ha sido la falta de líneas celulares murinas que se asemejan a lo agresivo y metastásico de HNSCCs humanas. Además, la mayoría de modelos murinos emplear implantes subcutáneos de los tumores que carecen de funciones fisiológicas importantes de la región de cabeza y cuello, incluyendo la alta densidad vascular y vasculatura linfática extensa flora residente mucosa. El propósito de este estudio es desarrollar y caracterizar un modelo ortotópico de HNSCC. Contamos con dos líneas celulares murinas genéticamente distintos y tumores establecidos en la mucosa bucal de ratones. Optimizar métodos de digestión de tumor de base de colagenasa para la recuperación óptima de las células de tumores establecidos. Los datos aquí presentados muestran que ratones desarrollan tumores altamente vascularizados que metastatizan a los ganglios linfáticos regionales. Análisis de citometría de masas multiparamétrico unicelular muestran la presencia de diversas poblaciones inmunes con células mieloides que representan a la mayoría de todas las células inmunes. El modelo propuesto en este estudio tiene aplicaciones en la biología del cáncer, Inmunología tumoral y desarrollo preclínico de nuevas terapias. El parecido del modelo ortotópico de características clínicas de la enfermedad humana le brindan una herramienta para la traducción mejorada y mejora los resultados del paciente.
Introduction
HNSCC es la malignidad más común en quinto lugar a nivel mundial, con más de 600.000 pacientes diagnosticados anualmente1. A pesar del tratamiento agresivo con quimioterapia y radioterapia (RT), la tasa general de supervivencia (SG) para pacientes HNSCC sin infección humana del papillomavirus (HPV) sigue siendo inferior al 50% después de 5 años2. Esto se atribuye principalmente a un microambiente tumoral compleja como pueden originar tumores de varios sitios anatómicos distintos dentro de la región de cabeza y cuello, incluyendo la mucosa bucal, lengua, piso de la boca, cavidad nasal, cavidad oral, faringe, Oropharynx y hypopharynx. Además, la región de cabeza y cuello es altamente vascularizada y contiene casi la mitad de todos los nodos de linfa en el cuerpo3. La mayoría de estudios que investigan la biología tumoral de cabeza y cuello se basan en modelos de tumores en la región de flanco. Tales modelos pueden ofrecer visión de mecanismos intrínsecos de tumor, pero la falta del microambiente natural de cabeza y cuello puede afectar significativamente el potencial traslacional de tales resultados. Un método que se ha utilizado para inducir tumores orales es a través de la exposición al carcinógeno 9, 10-Dimetil-1, 2-benzanthracene (DMBA)4. Sin embargo, este método está asociado a un proceso largo, induce tumores en ratas y hamsters pero no en ratones, y los tumores resultantes no poseen muchas de las características histológicas de SCCs diferenciados5,6. La introducción de la carcinogen4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO), un derivado de la quinolona soluble en agua, resultaron en tumores orales de ratón cuando se aplica por vía oral pero también sufrió de tiempos de exposición largos (16 semanas) y una limitada tome velocidad dentro y entre lotes de ratones7,8,9. Para desarrollar modelos clínicamente relevantes, varios grupos utilizaron modelos transgénicos que implican la manipulación de oncogenes de controlador o genes supresores de tumores, incluyendo TP53, TGFB, KRAS, HRAS y SMAD410. Estos modelos pueden ofrecer información sobre tumores con genes de la conductor conocido pero no recapitular la compleja heterogeneidad de HNSCCs humanas.
En este trabajo se demuestra la viabilidad de realizar una inoculación intramucosal de carcinoma de células escamosas células en ratones. Células inoculadas se convierten en tumores agresivos dentro de 1 semana de la inyección. Similar a la humanas HNSCCs, los tumores metastatizan a los ganglios linfáticos regionales. Caracterizar las características histológicas y clínicas de la enfermedad y proporcionar la penetración en el microambiente inmunológico del tumor. Proponemos que este modelo ortotópico de HNSCC tiene aplicaciones en Biología del cáncer, Inmunología tumoral y estudios preclínicos. Mecanismos de evasión inmune, resistencia al tratamiento, progresión tumoral y metástasis representan áreas de significación clínica que se puede abordar utilizando el modelo propuesto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Riguroso análisis y caracterización del microambiente tumoral representan una estrategia importante para los mecanismos de comprensión del desarrollo del tumor, la progresión y la metástasis y para el desarrollo de terapias efectivas. Cáncer de cabeza y cuello es una enfermedad compleja que puede originar de múltiples sitios anatómicos en la región de cabeza y cuello. Un impedimento importante para entender mecanismos de la enfermedad y mejorar la terapia ha sido la falta de líneas de células de ratón murino …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno
Materials
| Collagenase III | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corp. | LS006328 | |
| Fc Block (CD16/32) | BD Biosciences | 553141 | Clone 2.4G2 |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no pheno red |
| Helois mass cytometer | Fluidigm | NA | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB-40234B | |
| MRI Scanner | Bruker | NA | 7.4 Tesla |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420301 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington Biochemical Corp. | LS002830 |
References
- Chaturvedi, A. K., et al. Worldwide trends in incidence rates for oral cavity and oropharyngeal cancers. Journal of Clinical Oncology. 31 (36), 4550-4559 (2013).
- Ang, K. K., Sturgis, E. M. Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 128-142 (2012).
- Amin, M. B., et al. The Eighth Edition AJCC Cancer Staging Manual: Continuing to build a bridge from a population-based to a more "personalized" approach to cancer staging. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (2), 93-99 (2017).
- Salley, J. J. Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster. Journal of Dental Research. 33 (2), 253-262 (1954).
- Morris, A. L. Factors influencing experimental carcinogensis in the hamster cheek pouch. Journal of Dental Research. 40, 3-15 (1961).
- MacDonald, D. G. Comparison of epithelial dysplasia in hamster cheek pouch carcinogenesis and human oral mucosa. Journal of Oral Pathology & Medicine. 10 (3), 186-191 (1981).
- Hawkins, B. L., et al. 4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma. Head & Neck. 16 (5), 424-432 (1994).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vered, M., Yarom, N., Dayan, D. 4NQO oral carcinogenesis: animal models, molecular markers and future expectations. Oral Oncology. 41 (4), 337-339 (2005).
- Bornstein, S., et al. Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 119 (11), 3408-3419 (2009).
- Thomas, G. R., Chen, Z., Oechsli, M. N., Hendler, F. J., Van Waes, C. Decreased expression of CD80 is a marker for increased tumorigenicity in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma. International Journal of Cancer. 82 (3), 377-384 (1999).
- Yuspa, S. H., Hawley-Nelson, P., Koehler, B., Stanley, J. R. A survey of transformation markers in differentiating epidermal cell lines in culture. 암 연구학. 40 (12), 4694-4703 (1980).
- Chen, Z., Smith, C. W., Kiel, D., Van Waes, C. Metastatic variants derived following in vivo tumor progression of an in vitro transformed squamous cell carcinoma line acquire a differential growth advantage requiring tumor-host interaction. Clinical & Experimental Metastasis. 15 (5), 527-537 (1997).
- Euhus, D. M., Hudd, C., LaRegina, M. C., Johnson, F. E. Tumor measurement in the nude mouse. Journal of Surgical Oncology. 31 (4), 229-234 (1986).
- Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. NeuroImage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Dutta, S., et al. The relationship between tumour necrosis, tumour proliferation, local and systemic inflammation, microvessel density and survival in patients undergoing potentially curative resection of oesophageal adenocarcinoma. Britisch Journal of Cancer. 106 (4), 702-710 (2012).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research. 12 (4), 571-582 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Oweida, A., et al. Ionizing radiation sensitizes tumors to PD-L1 immune checkpoint blockade in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma. OncoImmunology. 6 (10), e1356153 (2017).
- Ferris, R., et al. Further evaluations of nivolumab (nivo) versus investigator’s choice (IC) chemotherapy for recurrent or metastatic (R/M) squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): CheckMate 141. Journal of Clinical Oncology. 34, (2016).
- Ferris, R. L., et al. Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1856-1867 (2016).
- Harrington, K. J., et al. Nivolumab versus standard, single-agent therapy of investigator’s choice in recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (CheckMate 141): health-related quality-of-life results from a randomised, phase 3 trial. The Lancet Oncology. 18 (8), 1104-1115 (2017).
- Kiyota, N., et al. A randomized, open-label, Phase III clinical trial of nivolumab vs. therapy of investigator’s choice in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck: A subanalysis of Asian patients versus the global population in checkmate 141. Oral Oncology. 73, 138-146 (2017).
- Ling, D. C., Bakkenist, C. J., Ferris, R. L., Clump, D. A. Role of Immunotherapy in Head and Neck Cancer. Seminars in Radiation Oncology. 28 (1), 12-16 (2018).
- Perri, F., et al. Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications. Head & Neck. 37 (5), 763-770 (2015).
- Yamamoto, V. N., Thylur, D. S., Bauschard, M., Schmale, I., Sinha, U. K. Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 63, 44-51 (2016).
- Bonner, J. A., et al. Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival. The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).
- Bhatia, S., et al. Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).
- Bhatia, S., et al. Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 6, 38792 (2016).
- Tang, C., et al. Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors?. Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).
- Oweida, A., et al. Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration. Clinical Cancer Research. , (2018).
