الإنتاجية المتوسطة فحص فحوصات لتقييم الآثار على Ca2 +-إشارات ورد فعل أكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية
Summary
هنا، واثنين من فحوصات الإنتاجية المتوسطة لتقييم الآثار على Ca2 +-يرد وصف رد فعل الإشارات وأكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية. يمكن استخدام هذه الاختبارات للشاشة بسرعة وسهولة كميات كبيرة من مركبات للآثار على Ca2 +-رد فعل الإشارات وأكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية.
Abstract
Ca2 +-مما يشير إلى أمر ضروري لوظيفة الخلية المنوية العادية وخصوبة الذكور. وبالمثل، رد فعل acrosome حيوية بالنسبة لقدرة خلية الحيوانات المنوية البشرية لاختراق بيلوسيدا زونا وتخصب البويضة. ولذا أهمية كبيرة لاختبار المركبات (مثلاً، المواد الكيميائية البيئية أو المرشحين المخدرات) لتأثيرها على Ca2 +-رد فعل الإشارات وأكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية أما إلى دراسة الآثار السلبية المحتملة على وظيفة الخلية المنوية البشرية أو للتحقيق في دور محتمل كوسائل منع الحمل. ويرد هنا، هما الإنتاجية المتوسطة فحوصات: 1) تحليل القائم على الأسفار لتقييم الآثار على Ca2 +-إشارات في الحيوانات المنوية البشرية، ومقايسة سيتوميتريك صورة 2) لتقييم رد الفعل أكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية. يمكن استخدام هذه الاختبارات لفحص عدد كبير من المركبات للآثار على Ca2 +-رد فعل الإشارات وأكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامها في فحوصات إنشاء منحنيات الاستجابة للجرعة محددة للغاية للمركبات الفردية، وتحديد الجمع/التآزر المحتملة لمركبات اثنين أو أكثر، ودراسة الوضع الدوائي للعمل عن طريق تثبيط المنافسة تجارب مع مثبطات كاتسبير.
Introduction
غرض فحوصات اثنين الموصوفة هنا دراسة الآثار على Ca2 +-رد فعل الإشارات وأكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية، كما أظهرت لمركبات متعددة في العديد من المنشورات التي توظف هذه فحوصات،1،2 3،،من45،،من67. Ca2 +-إشارات ورد فعل acrosome هي وظيفة الخلية المنوية البشرية الحيوية إلى وضعها الطبيعي وخصوبة الذكور.
والهدف العام لخلية الحيوانات المنوية البشرية تخصيب البويضة. لتكون قادراً على بنجاح وبشكل طبيعي تخصب البيضة، يجب أن ينظم وظائف الخلية المنوية محكم أثناء رحلة الخلية المنوية من خلال8،الأنثى التناسلي9. وتخضع العديد من وظائف الخلية المنوية عبر داخل الخلية Ca2 +-تركيز [Ca2 +]أنا (مثل الحيوانات المنوية حركية وانزيمية أكروسومي رد فعل)10. أيضا، هو عملية نضج تسمى تأهيلية، مما يجعل الخلية المنوية قادرة على إخصاب البيضة، ينظمها جزئيا [Ca2 +]أنا10. Ca2 +-البثق Ca2 +-ATPase مضخات11 الاحتفاظ إضعاف ما يقرب من 20.000 Ca2 +-التدرج عبر غشاء الخلية المنوية البشرية، مع يستريح [Ca2 +]أنا من 50-100 نانومتر. إذا Ca2 + يسمح بعبور غشاء الخلية (مثلاً، من خلال فتح Ca2 +-قنوات)، يحدث بتدفق إعداد كبيرة من Ca2 + ، مما أدى إلى ارتفاع من [Ca2 +]أنا. ومع ذلك، يحمل أيضا الخلية المنوية Ca داخل الخلية2 +-مخازن، والتي يمكن إصدار Ca2 + و، ولذلك، كما ترتفع تعطي ارتفاع من [Ca2 +]أنا12. من المثير للاهتمام، كل قناة بوساطة Ca2 +-حتى الآن تم العثور على التدفق في خلايا الحيوانات المنوية البشرية تحدث عن طريق كاتسبير (القطالقناة الأيونية جمعية مهندسي البترولrm)، التي يعبر عنها فقط في خلايا الحيوانات المنوية11. في خلايا الحيوانات المنوية البشرية، تنشيط كاتسبير البروجسترون يغاندس الذاتية والبروستاغلاندينات عن طريق يجند متميزة ملزم مواقع13،،من1415، مما أدى إلى كاليفورنيا سريع2 +-تدفق إلى الخلية المنوية. مصدرين رئيسيين قرب البيض توفير مستويات عالية من هذه يغاندس الذاتية. واحد هو سائل جرابي يحتوي على مستويات عالية من البروجسترون16. يتم تحرير السائل الجريبي من المسام ناضجة جنبا إلى جنب مع البيض في التبويض وتختلط مع السائل داخل أوفيدوكتس17. المصدر الرئيسي الآخر هو الخلايا الركام التي تحيط البيض والإفراج عن ارتفاع مستويات البروجسترون والبروستاغلاندينات. البروجسترون الناجمة عن Ca2 +-تدفق في خلايا الحيوانات المنوية قد ثبت للتوسط به نحو9،البيض18ومراقبة الحيوانات المنوية حركية19،20 وتحفز أكروسومي 21من رد الفعل. تحريك لهذه الفردية [Ca2 +[أنا-وظائف الحيوانات المنوية الخاضعة للتنظيم في الترتيب الصحيح وفي الوقت الصحيح أمر حاسم لاخصاب البيض8. وتمشيا مع هذا، دون المستوى الأمثل التي يسببها البروجسترون Ca2 +-تدفق تم العثور عليها لتكون مرتبطة مع انخفاض خصوبة الذكور22،،من2324،25،26 ،27،،من2829 وكاتسبير الفنية ضروري لخصوبة الذكور26،30،،من3132، 33،34،،من3536.
كما خلايا الحيوانات المنوية الوصول إلى البويضة، سلسلة أحداث يجب أن تتم للاخصاب تحدث: 1) خلايا الحيوانات المنوية يجب أن تخترق طبقة الخلايا الركام المحيطة، 2) ربط بيلوسيدا زونا، 3) اكسوسيتوسي محتوى أكروسومال، رد فعل ما يسمى أكروسومي 37, 4) اختراق بيلوسيدا زونا، و 5) تلتحم مع الغشاء البيض لإتمام الإخصاب38. لتكون قادرة على الذهاب من خلال هذه الخطوات وتخصب البيضة، الخلية المنوية أولاً يجب أن يخضع تأهيلية11، الذي يبدأ كما ترك السائل المنوي الذي يحتوي على “ديكاباسيتاتينج” عوامل39 خلايا الحيوانات المنوية وتسبح في السوائل للإناث المسالك التناسلية مع مستويات عالية من بيكربونات والزلال37. تأهيلية يجعل خلايا الحيوانات المنوية قادرة على الخضوع هايبراكتيفيشن، شكلاً من أشكال حركية مع ضربة قوية السوط، و رد فعل acrosome37. حركية هايبراكتيفاتيد مطلوب لتغلغل zona pellucida40، وأكروسومي يحتوي على الإنزيمات هيدروليكي المختلفة أن تساعد هذه العملية اختراق41. بالإضافة إلى ذلك، يجعل رد فعل acrosome خلايا الحيوانات المنوية القادرة على الصمامات مع البيض بتعريض بروتينات الغشاء محددة على سطح الحيوانات المنوية اللازمة للحيوانات المنوية-البيض الانصهار42. ونتيجة لذلك، القدرة على الخضوع لرد فعل هايبراكتيفيشن وأكروسومي على حد سواء اللازمة للاخصاب الناجح من40،البيض42. خلافا لما شهد للماوس الخلايا المنوية43،،من4445، يمكن ربط الخلايا المنوية البشرية إلا أن أكروسومي سليمة zona pellucida46. عندما خلايا الحيوانات المنوية البشرية بد أن بيلوسيدا زونا لديهم الخضوع لرد فعل أكروسومي لاختراق zona pellucida41 ولفضح بروتينات الغشاء محددة مطلوبة للانصهار مع البيض38. وهكذا توقيت رد الفعل أكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية أمر حاسم للتسميد بحيث تحدث.
كما هو موضح أعلاه، Ca2 +-مما يشير إلى أمر حيوي للحيوانات المنوية طبيعية الخلية الدالة8، وأنها، لذلك، أهمية كبيرة تكون قادرة على شاشة إعداد كبيرة من المركبات للآثار على Ca2 +-الإشارات في خلايا الحيوانات المنوية البشرية. وبالمثل، يمكن اختراق بيلوسيدا زونا خلايا الحيوانات المنوية إلا البشرية التي يخضع لها رد فعل أكروسومي في الوقت المناسب والمكان وتسميد46،البيض47، كما أنها ذات أهمية كبيرة لتكون قادرة على اختبار المركبات لقدرتها على تؤثر على رد فعل أكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية. وتحقيقا لهذه الغاية، يتم وصف اثنين الفرز الإنتاجية المتوسطة فحوصات: 1) تحليل للآثار على Ca2 +-الإشارات في خلايا الحيوانات المنوية البشرية، ومقايسة 2) لقدرته على الحث على رد فعل أكروسومي في خلايا الحيوانات المنوية البشرية.
هو مقايسة 1 إنتاجية متوسطة Ca2 +-يشير التحليل. هذا الأسلوب القائم على قارئ لوحة fluorescence ترصد التغيرات في الأسفار كدالة للزمن في آبار متعددة في وقت واحد. Ca2 +-صبغة الفلورسنت الحساسة، فلوو-4 قد أ كد ل Ca2 +≈ 335 نيوتن متر وهو خلية بيرمينت على شكل إستر صباحا (أسيتوكسيميثيل). استخدام فلوو-4، من الممكن لقياس التغيرات في [Ca2 +[i مع مرور الوقت، وبعد إضافة مركبات للاهتمام بخلايا الحيوانات المنوية. المقايسة وضع المختبر من تيمو Strünker في 201113 واستخدم منذ ذلك الحين في عدة دراسات لمركبات الشاشة للآثار على Ca2 +-إشارات في الحيوانات المنوية البشرية1،2،3، 4،5. كما تم استخدام أسلوب مشابه لفحص المخدرات متعددة المرشحين48. وبالإضافة إلى ذلك، هذا التحليل أيضا مفيدة لتقييم طريقة العمل1،2،3،،من45، منحنيات الاستجابة للجرعة1، الدوائي 2،3،،من45وتثبيط المنافسة1،2، والجمع1،2، و التعاضد3 من المركبات ذات الأهمية.
المقايسة 2 مقايسة رد فعل acrosome الإنتاجية المتوسطة. هذا الأسلوب القائم على سيتوميتير صورة تدابير كمية قابلة للتطبيق acrosome رد فعل الخلايا المنوية في عينة، استخدام الأصباغ الفلورية ثلاثة: يوديد propidium (PI)، إلى جانب فيتك يكتين بسام بيسوم (فيتك-PSA)، و 33342 هويشت. تم تعديله من أسلوب يستند إلى قياس تدفق مماثل من قبل زوبينو et al.49 الفحص وقد استخدمت في عدة دراسات6،7. أما بالنسبة Ca2 +-يشير التحليل، يمكن أيضا استخدام هذا الفحص رد فعل أكروسومي لتقييم منحنيات الاستجابة للجرعة وتثبيط، والجمع، والتآزر من المركبات ذات الأهمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإنتاجية المتوسطة Ca2 + إشارات والرزن هو استناداً إلى قياسات للأسفار من كل واحد ميكروويلس تحتوي على حوالي 250,000 الخلايا المنوية. هو المتوسط الإشارات الملتقطة من جميع خلايا الحيوانات المنوية الفردية في البئر. وهكذا تنص المقايسة يتم تغيير أية معلومات مكانية حول مكان على وجه التحديد في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن ينوه المختبر من تيمو Strünker للإشراف على ع و DLE أثناء تلك الإقامة في مختبرة. وعلاوة على ذلك، نود أن نشكر زملائنا في إدارة النمو والتكاثر، مستشفى جامعة كوبنهاغن، ريجشوسبيتاليت لمساعدتها بإعداد هذه الاختبارات اثنين. وأيد هذا العمل منح من “صندوق الابتكار” الدانمرك (أرقام المنح 005-2010-3 و 14-2013-4).
Materials
| 0.2 µm pore filter | Thermo Fisher Scientific, USA | 296-4545 | |
| 1 L measuring cylinder | Thermo Fisher Scientific, USA | 3662-1000 | |
| 1,4 and 2 mL plastic tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 and 0030120094 | |
| 12-channel pipette | Eppendorf, Germany | 4861000813 | |
| 384 multi-well plates | Greiner Bio-One, Germany | 781096 | |
| 15 and 50 mL platic tubes | Eppendorf, Germany | 0030122151 and 30122178 | |
| A2-slide | ChemoMetec, Denmark | 942-0001 | |
| Automatic repeater pipette | Eppendorf, Germany | 4987000010 | |
| CaCl2 | |||
| Centrifuge | |||
| Clean wide-mouthed plastic container for semen sample | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) | Sigma-Aldrich, Germany | L0770 | |
| Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific, USA | F14201 | |
| FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader | BMG Labtech, Germany | ||
| Glucose anhydrous | |||
| HEPES | |||
| Hoechst-33342 | ChemoMetec, Denmark | 910-3015 | |
| Human serum albumin (HSA) | Irvine Scientific | 9988 | For addition to HTF+ |
| Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water | |||
| Incubator | |||
| KCl | |||
| KH2PO4 | |||
| Magnetic stirrer | |||
| MgSO4 | |||
| Na-Lactate | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| NC-3000 image cytometer | ChemoMetec, Denmark | 970-3003 | |
| Pipettes and piptting tips | |||
| propidium iodide (PI) | ChemoMetec, Denmark | 910-3002 | |
| Purified water | |||
| Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle | |||
| S100 buffer | ChemoMetec, Denmark | 910-0101 | |
| SP1-cassette | ChemoMetec, Denmark | 941-0006 | |
| Volumetric flasks of appropriate sizes | |||
| Vortexer |
References
- Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. , (2014).
- Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrinology. 157 (11), 4297-4308 (2016).
- Brenker, C., et al. Synergistic activation of CatSper Ca2+ channels in human sperm by oviductal ligands and endocrine disrupting chemicals. Human Reproduction (Oxford, England). 33 (10), 1915-1923 (2018).
- Brenker, C., et al. The CatSper channel: a polymodal chemosensor in human sperm. The EMBO Journal. 31 (7), 1654-1665 (2012).
- Brenker, C., et al. Action of steroids and plant triterpenoids on CatSper Ca2+ channels in human sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E344-E346 (2018).
- Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. , (2017).
- Egeberg Palme, D. L., et al. Viable acrosome-intact human spermatozoa in the ejaculate as a marker of semen quality and fertility status. Human Reproduction. , (2018).
- Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm–making the most of what you’ve got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
- Publicover, S. J., et al. Ca2+ signalling in the control of motility and guidance in mammalian sperm. Frontiers in Bioscience. 13, 5623-5637 (2008).
- Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm–making the most of what you’ve got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
- Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Of Physiology. 74, 453-475 (2012).
- Morris, J., et al. Cell-penetrating peptides, targeting the regulation of store-operated channels, slow decay of the progesterone-induced [Ca2+]i signal in human sperm. Molecular Human Reproduction. 21 (7), 563-570 (2015).
- Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471 (7338), 382-386 (2011).
- Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471 (7338), 387-391 (2011).
- Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science (New York, N.Y.). 352 (6285), 555-559 (2016).
- Revelli, A., et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology And Endocrinology RB&E. 7, 40 (2009).
- Lyons, R. A., Saridogan, E., Djahanbakhch, O. The effect of ovarian follicular fluid and peritoneal fluid on Fallopian tube ciliary beat frequency. Human Reproduction. 21 (1), 52-56 (2006).
- Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Sperm guidance in mammals – an unpaved road to the egg. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 7 (4), 276-285 (2006).
- Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28 (4), 866-876 (2013).
- Alasmari, W., et al. Ca2+ signals generated by CatSper and Ca2+ stores regulate different behaviors in human sperm. The Journal of Biological Chemistry. 288 (9), 6248-6258 (2013).
- Tamburrino, L., et al. The CatSper calcium channel in human sperm: relation with motility and involvement in progesterone-induced acrosome reaction. Human Reproduction. 29 (3), 418-428 (2014).
- Krausz, C., et al. Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction. 10 (1), 120-124 (1995).
- Oehninger, S., et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. Fertility and Sterility. 61 (2), 349-354 (1994).
- Shimizu, Y., Nord, E. P., Bronson, R. A. Progesterone-evoked increases in sperm [Ca2+]i correlate with the egg penetrating ability of sperm from fertile but not infertile men. Fertility and Sterility. 60 (3), 526-532 (1993).
- Falsetti, C., et al. Decreased responsiveness to progesterone of spermatozoa in oligozoospermic patients. Journal of Andrology. 14 (1), 17-22 (1993).
- Williams, H. L., et al. Specific loss of CatSper function is sufficient to compromise fertilizing capacity of human spermatozoa. Human Reproduction. 30 (12), 2737-2746 (2015).
- Forti, G., et al. Effects of progesterone on human spermatozoa: clinical implications. Annales d’Endocrinologie. 60 (2), 107-110 (1999).
- Krausz, C., et al. Two functional assays of sperm responsiveness to progesterone and their predictive values in in-vitro fertilization. Human Reproduction. 11 (8), 1661-1667 (1996).
- Kelly, M. C., et al. Single-cell analysis of [Ca2+]i signalling in sub-fertile men: characteristics and relation to fertilization outcome. Human Reproduction. 33 (6), 1023-1033 (2018).
- Brown, S. G., et al. Homozygous in-frame deletion in CATSPERE in a man producing spermatozoa with loss of CatSper function and compromised fertilizing capacity. Human Reproduction. 33 (10), 1812-1816 (2018).
- Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84 (4), 505-510 (2009).
- Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6823-6828 (2013).
- Hildebrand, M. S., et al. Genetic male infertility and mutation of CATSPER ion channels. European Journal of Human Genetics. 18 (11), 1178-1184 (2010).
- Avidan, N., et al. CATSPER2, a human autosomal nonsyndromic male infertility gene. European Journal of Human Genetic. 11 (7), 497-502 (2003).
- Zhang, Y., et al. Sensorineural deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. BMJ Case Reports. 2009, (2009).
- Jaiswal, D., Singh, V., Dwivedi, U. S., Trivedi, S., Singh, K. Chromosome microarray analysis: a case report of infertile brothers with CATSPER gene deletion. Gene. 542 (2), 263-265 (2014).
- Visconti, P. E., Krapf, D., de la Vega-Beltrán, J. L., Acevedo, J. J., Darszon, A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian Journal of Andrology. 13 (3), 395-405 (2011).
- Wassarman, P. M., Jovine, L., Litscher, E. S. A profile of fertilization in mammals. Nature Cell Biology. 3 (2), E59-E64 (2001).
- Leahy, T., Gadella, B. M. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction. 142 (6), 759-778 (2011).
- Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
- Liu, D. Y., Baker, H. W. Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biology of Reproduction. 48 (2), 340-348 (1993).
- Okabe, M. The cell biology of mammalian fertilization. Development. 140 (22), 4471-4479 (2013).
- Inoue, N., Satouh, Y., Ikawa, M., Okabe, M., Yanagimachi, R. Acrosome-reacted mouse spermatozoa recovered from the perivitelline space can fertilize other eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20008-20011 (2011).
- Jin, M., et al. Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before contact with the zona pellucida during in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4892-4896 (2011).
- Hirohashi, N., Yanagimachi, R. Sperm acrosome reaction: its site and role in fertilization. Biology of Reproduction. 99 (1), 127-133 (2018).
- Liu, D. Y., Garrett, C., Baker, H. W. G. Acrosome-reacted human sperm in insemination medium do not bind to the zona pellucida of human oocytes. International Journal of Andrology. 29 (4), 475-481 (2006).
- Overstreet, J. W., Hembree, W. C. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro. Fertility and Sterility. 27 (7), 815-831 (1976).
- Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. , 1-11 (2017).
- Zoppino, F. C. M., Halón, N. D., Bustos, M. A., Pavarotti, M. A., Mayorga, L. S. Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Fertility and Sterility. 97 (6), 1309-1315 (2012).
- Mata-Martínez, E., et al. Measuring intracellular Ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging. Journal of Visualized Experiments. (75), e50344 (2013).
- Egeberg, D. L., et al. Image cytometer method for automated assessment of human spermatozoa concentration. Andrology. 1 (4), 615-623 (2013).
- Nash, K., et al. Techniques for imaging Ca2+ signaling in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).
