Medium-throughput Screening tests voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma

Summary

Hier, twee medium-throughput assays voor de beoordeling van effecten op Ca^{2 +}-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma worden beschreven. Deze tests kunnen worden gebruikt om te sluiten snel en eenvoudig grote hoeveelheden compounds voor effecten op Ca^{2 +}-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma.

Abstract

CA^{2 +}-signalering is essentieel voor normale spermacel functie en mannelijke vruchtbaarheid. Ook is de Acrosoom reactie essentieel voor het vermogen van een menselijke spermacel bevruchten van de eicel te doordringen van de zona zitten. Het is daarom van groot belang voor het testen van de verbindingen (bijvoorbeeld milieu chemicaliën of drugkandidaten) voor hun effect op Ca^{2 +}-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma te onderzoeken van de potentiële schadelijke effecten op de menselijke spermacel functie of om te onderzoeken een mogelijke rol als een voorbehoedsmiddel. Hier twee medium-throughput assays worden beschreven: 1) een fluorescentie gebaseerde assay voor de beoordeling van effecten op Ca^{2 +}-signalering in menselijk sperma, en 2) een kwantitatieve analyse van beeld, cytometrische voor beoordeling van Acrosoom reactie in het menselijk sperma. Deze tests kunnen worden gebruikt om een groot aantal compounds voor effecten op Ca^{2 +}scherm-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma. Bovendien, de testen te genereren zeer specifieke dosis / respons-curven van afzonderlijke verbindingen, potentiële additiviteit/synergie voor twee of meer verbindingen bepalen, en te bestuderen van het farmacologische werkingsmechanisme via competitieve remming kunnen worden gebruikt experimenten met CatSper-remmers.

Introduction

Het doel van de twee tests die hier beschreven is het onderzoeken van de effecten op Ca^{2 +}-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma, zoals is aangetoond voor meerdere verbindingen in diverse publicaties met deze testen^{1,2, 3,4,},^5,,^6,7. CA^{2 +}-signalering en de Acrosoom reactie zijn beide essentieel voor normale menselijke spermacel functie en mannelijke vruchtbaarheid.

Het algemene doel van een menselijke zaadcel is om te bevruchten het ei. Om te kunnen met succes en natuurlijk bevruchten het ei, moeten de functies van de spermacel strak worden geregeld tijdens de reis van de spermacel tot en met het vrouwelijke voortplantingssysteem^8,9. Veel van de functies van de spermacel worden geregeld via de intracellulaire Ca^{2 +}-concentratie [Ca^{2 +}]_ik (bijvoorbeeld een sperma motiliteit, chemotaxis en Acrosoom reactie)¹⁰. Ook is een rijpingsproces genaamd rechtsbevoegdheid, waardoor de spermacel kan de eicel bevruchten, deels gereguleerd door [Ca^{2 +}]_ik¹⁰. CA^{2 +}-diepte Ca^{2 +}-ATPase pompen¹¹ handhaven een ongeveer 20.000 vouw Ca^{2 +}-gradiënt over het menselijk sperma celmembraan, met een rust [Ca^{2 +}]_ik van 50-100 nM. Als Ca^{2 +} is toegestaan te steken van de celmembraan (bijvoorbeeld door de opening van Ca^{2 +}-kanalen), een flinke toestroom van Ca^{2 +} optreedt, die aanleiding geven tot een hoogte van [Ca^{2 +}]_ik. De spermacel draagt echter ook intracellulaire Ca^{2 +}-winkels, die Ca^{2 vrijkomen kunnen +} en, derhalve, ook geven een hoogte van [Ca^{2 +}]_i¹²stijgen. Interessant is dat alle kanaal-gemedieerde Ca^{2 +}-instroom in menselijke zaadcellen tot nu toe is gebleken dat optreden via CatSper (katIonische kanaal van Sperm), die alleen wordt uitgedrukt in zaadcellen¹¹. In menselijke zaadcellen, CatSper wordt geactiveerd door de endogene liganden progesteron en prostaglandines via verschillende ligand bindend sites^13,14,15, leiden tot een snelle Ca^{2 +}-instroom in de spermacel. Twee hoofdbronnen in de buurt van het ei bevatten hoge niveaus van deze endogene liganden. Een is de folliculaire vloeistof die hoge niveaus van progesteron^{16 bevat}. De folliculaire vloeistof wordt vrijgelaten uit de rijpe follikels samen met de eicel bij ovulatie en mixen met de vloeistof binnen de oviducts¹⁷. De andere belangrijkste bron is de cumulus cellen die omringen het ei en vrijgeven van hoge niveaus van progesteron en prostaglandines. De progesteron geïnduceerde Ca^{2 +}-instroom in de zaadcellen heeft aangetoond dat bemiddelen chemotaxis naar de ei^9,18,^19,20 van de beweeglijkheid van de zaadcellen bepalen en stimuleren het Acrosoom reactie²¹. Triggering van deze individuele [Ca^{2 +}]_ik-gereglementeerde sperma functies in de juiste volgorde en op het juiste moment is van cruciaal belang voor de bevruchting van de eicel⁸. In overeenstemming met deze, een suboptimaal progesteron geïnduceerde Ca^{2 +}-instroom is gebleken dat geassocieerd met verminderde mannelijke vruchtbaarheid^{22,23,24,25,26 ,27,28,29} en functionele CatSper is essentieel voor de mannelijke vruchtbaarheid^{26,30,31,32, 33,34,35},^,36.

Als de zaadcellen de eicel te bereiken, een opeenvolging van gebeurtenissen moet plaatsvinden voor bevruchting optreden: 1) de zaadcellen moeten doordringen in de omringende cellaag van cumulus, 2) binden aan de zona zitten, 3) de acrosomal inhoud, de zogenaamde Acrosoom reactie exocytose ³⁷, 4) dringen de zona zitten, en 5) zekering met het membraan van de eicel te voltooien bevruchting³⁸. Om te kunnen deze stappen doorlopen en bevruchten het ei, moet de spermacel eerst rechtsbevoegdheid¹¹, die begint als de zaadcellen verlaten de zaadvocht vloeistof met “decapacitating” factoren³⁹ en in het vocht van de vrouw zwemmen ondergaan voortplantingssysteem met hoge niveaus van bicarbonaat en albumine³⁷. Rechtsbevoegdheid maakt kundig voor hyperactivering, een vorm van beweeglijkheid met een krachtige gewonnen van het flagellum en Acrosoom reactie³⁷ondergaan de zaadcellen. De beweeglijkheid van de Hyperactivated is vereist voor de penetratie van de zona zitten⁴⁰, en de Acrosoom bevat verschillende hydrolytische enzymen die deze penetratie proces^{41 helpen}. Bovendien maakt de Acrosoom reactie de zaadcellen kunnen versmelten met het ei door specifieke membraaneiwitten op het sperma oppervlak nodig voor sperma-ei fusion⁴²bloot te leggen. Bijgevolg, het vermogen om te hyperactivering en Acrosoom reactie ondergaan zijn beide nodig zijn voor een succesvolle bevruchting van de eicel^40,42. In tegenstelling tot wat is gezien voor muis zaadcellen^43,44,45, kunt alleen menselijk sperma cellen die Acrosoom-intacte binden aan de zona zitten⁴⁶. Wanneer de menselijke zaadcellen zijn gebonden aan de zona zitten die zij moeten ondergaan de Acrosoom reactie te doordringen van de zona zitten⁴¹ zowel specifieke membraaneiwitten die nodig zijn voor de fusie met de ei-³⁸bloot te stellen. De timing van de Acrosoom reactie in het menselijk sperma is dus essentieel voor bevruchting optreden.

Zoals hierboven beschreven, Ca^{2 +}-signalering is van vitaal belang voor sperma van normale cel functie⁸, en het is daarom van groot belang voor zitten kundig voor scherm groot aantal compounds voor effecten op Ca^{2 +}-signalering in menselijke zaadcellen. Op dezelfde manier zoals alleen menselijke zaadcellen die ondergaan Acrosoom reactie op de juiste tijd en plaats kan doordringen van de zona zitten en het ei^{46,47 bevruchten}, is het ook van groot belang om het testen van de verbindingen om hun vermogen om te kunnen invloed op de reactie van de Acrosoom in menselijk sperma. Te dien einde twee medium-throughput screening tests worden beschreven: 1) een bepaling voor effecten op Ca^{2 +}-signalering in menselijke zaadcellen, en 2) een bepaling voor de capaciteit voor het opwekken van Acrosoom reactie in menselijke zaadcellen.

Assay 1 is een medium-doorvoer Ca^{2 +}-signalering assay. Deze fluorescentie plaat lezer gebaseerde techniek registreert wijzigingen in fluorescentie als functie van de tijd gelijktijdig in meerdere wells. De Ca^{2 +}-gevoelige fluorescente kleurstof, Fluo-4 heeft een K_d voor Ca^{2 +}≈ 335 nM en is cel-permeant in de vorm van de ester AM (acetoxymethyl). Met behulp van Fluo-4, is het mogelijk voor het meten van veranderingen in [Ca^{2 +}]_i na verloop van tijd en na toevoeging van verbindingen van belang zijn voor de zaadcellen. De test werd ontwikkeld door het laboratorium van Timo Strünker in 2011¹³ en wordt sindsdien gebruikt in verschillende studies naar scherm verbindingen voor effecten op Ca^{2 +}-signalering in menselijk sperma^{1,2,3, 4,5}. Ook is een gelijkaardige methode gebruikt om het scherm van meerdere drugs kandidaten⁴⁸. Bovendien, is deze test ook nuttig voor de beoordeling van de farmacologische modus van actie^1,2,3,4,5, dosis / respons-curven^{1, 2,3,4,5}, competitieve remming^1,2, additiviteit^1,2en synergie³ van verbindingen van belang.

Assay 2 is een medium-doorvoer Acrosoom reactie test. Deze afbeelding cytometer gebaseerde techniek meet de hoeveelheid levensvatbare Acrosoom reageerde zaadcellen in een monster met behulp van drie fluorescente kleurstoffen: propidium jodide (PI), FITC-coupled lectine van Pisum sativum (FITC-PSA) en Hoechst-33342. De bepaling van een gelijkaardige stroom cytometry gebaseerde methode is bewerkt door Zoppino et al.⁴⁹ en is gebruikt in diverse studies^6,7. Wat betreft de Ca^{2 +}-signalering assay, deze Acrosoom reactie test kan ook worden gebruikt om te beoordelen van de dosis / respons-curven, remming, additiviteit en synergie van stoffen van belang.

Protocol

De verzameling en analyse van menselijk sperma monsters in de protocollen volgt de richtsnoeren van de ethische commissie van onderzoek voor de regio van de hoofdstad van Denemarken. Alle sperma monsters zijn verkregen na de geïnformeerde toestemming van vrijwillige donoren. Na de levering, de monsters werden volledig anoniem gemaakt. Voor hun ongemak ontvangen elke donor een vergoeding van 500 DKK (ongeveer $75 dollar) per monster. De monsters werden geanalyseerd op de dag van levering en vervolgens vernietigd onmiddel…

Representative Results

Vertegenwoordiger resultaten van een experiment dat het testen van het effect van 4 verbindingen (A, B, C en D) samen met een positieve (progesteron) en negatieve (buffer) controle op [Ca2 +]i in menselijk sperma met behulp van de middellange-doorvoer Ca2 +-signalering bepaling kan worden gezien in figuur 4a. In figuur 4b, wordt een dosis-responscurve van progesteron weergegeven, die was afgeleid …

Discussion

De middellange doorvoer Ca^{2 +} signalering assay is gebaseerd op metingen van de fluorescentie van elk één microwells dat bevat ongeveer 250.000 zaadcellen. Het vastgelegde signaal is gemiddeld van alle individuele zaadcellen in de put. De bepaling vormt dus dat geen ruimtelijke informatie over waar u specifiek in de spermacel [Ca^{2 +}]_ik wordt gewijzigd, in hoe groot een deel van de zaadcellen een verandering in [Ca^{2 +}]_i vindt plaats, of hoe heterogene het antwoord i…

Materials

0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer