Determinação da taxa de fertilização do ovo de Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética
Summary
Apresentamos uma técnica citogenética simples usando ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para determinar a taxa de fertilização e principal razão sexual do haplodiploid invasiva Praga Bemisia tabaci.
Abstract
Umas poucas espécies de sugadores de seiva whiteflies são algumas das mais danosas pragas terrestres em todo o mundo devido o que eles causem danos à lavoura e vírus de planta que eles vector. Apesar de numerosos estudos da biologia destas espécies em diferentes ambientes, um parâmetro chave história de vida, relações de sexo de prole, tem recebido pouca atenção, no entanto, é importante para prever a dinâmica populacional. A proporção sexual primária (proporção sexual em oviposição) de Bemisia tabaci nunca foi relatada, mas podem ser encontrada, determinando a taxa de fertilização do ovo deste insecto haplodiploid. A técnica envolve a dechorionation de ovos com água sanitária, uma série de etapas de fixação e a aplicação da geral DNA fluorescente mancha, DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole, um corante fluorescente de DNA-ligando), para ligar a pró-núcleos masculinos e femininos. Aqui, apresentamos a técnica e um exemplo de sua aplicação, para testar se uma bactéria endossimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, influenciado a proporção sexual primária de b. tabaci. Esse método pode auxiliar nos estudos de população da whiteflies, ou para determinar se a alocação de sexo existe com certos estímulos ambientais.
Introduction
O estudo da alocação de sexo, ou o investimento relativo em prole masculina e feminina, é uma pedra angular da ecologia comportamental1,2,3. Além de seu poder para testar modelos adaptáveis de comportamento, saber que a estratégia de alocação de sexo de um organismo pode melhorar modelos de sua dinâmica populacional. Em muitas espécies, alocação de sexo é controlada por mães. Para determinar a alocação de sexo, é importante determinar a proporção sexual primária ou a proporção de fêmeas no momento da deposição do ovo. Embora a proporção sexual na emergência de adultos pode fornecer pistas para alocação de sexo, diferencial do desenvolvimento mortalidade entre machos e fêmeas juvenis pode comumente inclinar a proporção sexual adulta substancialmente. Em algumas espécies de Hymenoptera, a ordem de insetos que contém formigas, abelhas e vespas, determinou-se a proporção sexual primária com ensaios citogenéticos, manchando os embriões para exibir genético DNA. Porque hymenopterans são haplodiploid, um ovo masculino incipiente é haploide e contém apenas o pronucleus feminino (n), enquanto os óvulos femininos incipientes são diploides e contêm pró-núcleos masculinos e femininos (2n). Embora Aleyrodidae, sap-alimentação da família dos Hemiptera (Hemiptera) conhecido como whiteflies, são também haplodiploid, não houve um ensaio estabelecido para encontrar a proporção sexual primária nesses insetos. Este é talvez surpreendente dada a intensidade do estudo das poucas pragas sérias cosmopolitas nesta família e a importância das relações de sexo em interações competitivas de whiteflies4,5,6,7 ,8,9,10 e na dinâmica da população em geral. Em haplodiploid insetos também, relações de sexo são ilimitadas por sistemas de determinação do sexo, permitindo a possibilidade de fertilização seletiva e lábil razões sexuais que variam de acordo com o meio ambiente2. Aqui apresentamos uma técnica para determinar a proporção sexual primária do complexo espécie de whiteflies, conhecidos coletivamente como a mosca branca sweetpotato, b. tabaci. Este nome de uma espécie engloba mais de 28 espécies no mundo11e inclui alguns dos mais danosas pragas invasoras global12,13. A aplicação desta técnica para determinar os padrões de alocação de sexo no b. tabaci e outro Aleyrodidae permitirá uma investigação mais rigorosa das variáveis, incluindo temperatura, planta hospedeira, bactérias endossimbióticas ou planta/mosca branca patógenos, que possam influenciar razões sexuais primárias de mosca branca e dinâmica da população de mosca branca.
Nós somos inconscientes de qualquer técnicas de ovo de coloração comparáveis de b. tabaci. O protocolo é conveniente em comparação com métodos de coloração utilizados para outros ovos de inseto14 como omite uma etapa de fixação durante a noite e, portanto, pode ser concluída dentro de 3 h. Como um exemplo de um aplicativo, uma bactéria endossimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, está associado com viés feminino em nossas linhas de laboratório de b. tabaci Médio Oriente-Ásia menor 1 (MEAM1)15,16. Em uma linha de laboratório da b. tabaci MEAM1 (“MAC1,” recolhidos no centro agrícola de Maricopa), testamos se Rickettsia-infectados (R.+) fêmeas fertilizam mais ovos do que os não infectados fêmeas (R.–).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo é o primeiro a capturar a taxa de fertilização ou primária proporção sexual de b. tabaci. O desafio do presente protocolo é que ele requer pesquisadores aprender a lidar com os ovos da mosca branca rapidamente, garantindo que não mais de 1h se passou desde que os ovos foram oviposited até que eles são fixos. Durante experimentos preliminares, os ovos que foram corrigidos em 3h ou mais postoviposition eram muito velhos para observar a fecundação, como syngamy tinha ocorrido e divisões …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada por uma concessão de NSF (DEB-1020460) para M.S.H. e um subsídio de USDA AFRI (2010-03752) para M.S.H. Os autores graças a Brennan Zehr para coloração de ovos de mosca branca com muita habilidade e Zen. Os autores agradecer a Mike Riehle permitindo o uso de seu microscópio fluorescente para a imagem latente. Os autores agradecer Suzanne Kelly e Marco Gebiola as imagens de ovo. Os autores Obrigado Suzanne Kelly e Jimmy Conway para ajudar nos momentos cruciais durante os experimentos.
Materials
| 1XPBS | Any | ||
| 1XTBST | Any | 5X solution made from 30g Tris, 43.8g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0g NaN3 pH7.5, and brought to 1L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10X magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18mm x 18mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
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