Determinar la tasa de fertilización de huevos de Bemisia tabaci mediante una técnica citogenética
Summary
Presentamos una sencilla técnica citogenética 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para determinar la tasa de fertilización y primaria cociente del sexo de la plaga invasora del haplodiploid Bemisia tabaci.
Abstract
Algunas especies de moscas blancas chupando savia son algunas de las plagas más dañinas de terrestres en todo el mundo debido a los daños que causan y que vector de virus de plantas. A pesar de numerosos estudios de la biología de estas especies en diferentes ambientes, un parámetro clave historia de la vida, proporción de sexos de crías, ha recibido poca atención, sin embargo, es importante para predecir la dinámica de la población. El principal sex ratio (cociente del sexo en oviposición) de Bemisia tabaci no se ha divulgado nunca pero puede encontrarse determinando la tasa de fertilización de huevos de este insecto haplodiploid. La técnica implica la dechorionation de huevos con bleach, una serie de pasos de fijación y la aplicación de la general mancha fluorescente del ADN, DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole, un colorante fluorescente de ADN), para enlazar a los pronúcleos femeninos y masculinos. Aquí, presentamos la técnica y un ejemplo de su aplicación, para probar si una bacteria endosimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, había influenciado la principal proporción de sexos de B. tabaci. Este método puede ayudar en los estudios de población de mosca blanca, o determinar si existe asignación sexo con ciertos estímulos ambientales.
Introduction
El estudio de asignación de sexo, o la inversión relativa en la descendencia masculina y femenina, es una piedra angular de la ecología conductual1,2,3. Además de su poder para probar modelos adaptativos de comportamiento, conocer la estrategia de asignación de sexo de un organismo puede mejorar modelos de la dinámica de su población. En muchas especies, asignación de sexo es controlada por las madres. Para determinar la asignación de sexo, es importante determinar la proporción de sexos primaria o la proporción de hembras en el momento de la deposición del huevo. Aunque el cociente del sexo en adultos aparición pueden proporcionar pistas para la asignación de sexo, mortalidad desarrollo diferencial entre los juveniles masculinos y femeninos puede comúnmente sesgar la proporción de sexos adultos substancialmente. En algunas especies de himenópteros, la orden de insectos que incluye hormigas, abejas y avispas, la principal proporción de sexos se ha determinado mediante ensayos citogenéticos, tinción de los embriones para ver genética ADN. Porque agroecosistemas son haplodiploid, un incipiente huevo macho es haploide y contiene sólo el pronúcleo femenino (n), mientras que huevos mujer incipientes son diploides y contienen pronúcleos masculinos y femeninos (2n). Aunque Aleyrodidae, la familia sap-alimentación de chinches (Hemiptera) conocido como moscas blancas, son también haplodiploid, no ha sido un ensayo establecido para encontrar la proporción de sexos primaria en estos insectos. Esto quizás es sorprendente dada la intensidad de estudio de los pocos parásitos serios cosmopolitas en esta familia y la importancia de la proporción de sexos en interacciones competitivas de moscas blancas4,5,6,7 ,8,9,10 y en la dinámica de la población general. En los insectos haplodiploid, cocientes del sexo no tienen restricciones de sistemas de determinación del sexo, permitiendo la posibilidad de la fertilización selectiva y lábiles cocientes del sexo que varían con el medio ambiente2. Presentamos aquí una técnica para determinar la proporción de sexos primaria del complejo de especies de moscas blancas conocidos colectivamente como la mosca blanca del camote, B. tabaci. Este nombre de una especie abarca más de 28 especies en todo el mundo11e incluye algunos de los más dañinos plagas invasoras global12,13. La aplicación de esta técnica para determinar los patrones de asignación de sexo en B. tabaci y otra Aleyrodidae permitirá una investigación más rigurosa de las variables, como temperatura, planta huésped, las bacterias endosimbióticas o planta/mosca blanca patógenos, que pueden influir en mosca blanca primaria sexo relaciones y dinámica de poblaciones de mosca blanca.
Somos inconscientes de cualquier técnica de manchas de huevo comparable de B. tabaci. El protocolo es conveniente en comparación con métodos de tinción utilizados para otros insectos huevos14 ya que omite un paso de fijación durante la noche y por lo tanto, se puede terminar dentro de 3 h. Como un ejemplo de una aplicación, una bacteria endosimbiótica, Rickettsia SP. nr. bellii, se asocia con sesgo femenino en nuestras líneas de laboratorio de B. tabaci Medio Oriente Asia menor 1 (MEAM1)15,16. En una línea de laboratorio MEAM1 B. tabaci («MAC1,”recogidos desde el centro agrícola de Maricopa), probamos si Rickettsia-infectados (R+) hembras fertilizan más huevos que las hembras no infectadas de (R–).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo es el primero en capturar la tasa de fertilización o de masculinidad primaria de B. tabaci. El reto de este protocolo es que requiere de los investigadores a aprender cómo manejar los huevos de la mosca blanca rápidamente, asegurándose de que no más de 1 h ha pasado desde que los huevos eran ovipositaron hasta que son fijos. En experimentos preliminares, huevos que fueron fijados en 3 h o más postoviposition eran demasiado viejos para observar fecundación, como había ocurrido syngamy y div…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por una subvención de NSF (DEB-1020460) a M.S.H. y una subvención del USDA AFRI (2010-03752) a M.S.H. Los autores agradecen que Brennan Zehr coloración de huevos de mosca blanca con mucha habilidad y Zen. Los autores agradecen que Mike Riehle permitiendo el uso de su microscopio de fluorescencia para la proyección de imagen. Los autores agradecen a Suzanne Kelly y Marco Gebiola para las imágenes de huevo. Los autores agradecen a Suzanne Kelly y Jimmy Conway para ayudar en momentos cruciales durante los experimentos.
Materials
| 1XPBS | Any | ||
| 1XTBST | Any | 5X solution made from 30g Tris, 43.8g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0g NaN3 pH7.5, and brought to 1L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10X magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18mm x 18mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
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