Farelerde hyaloid damarlarının değerlendirilmesi ve karakterize edilmesi
Summary
Bu protokol hem in vivo hem de ex vivo metotları, hiyoid damarların, fare gözlerindeki vasküler regresyon modeli, canlı görüntüleme ve ex vivo için optik uyum tomografi ve fundus florcein anjiyografi kullanılarak tam olarak görselleştirilmesi ve karakterize edilmesini tanımlar. izolasyon ve nicel analiz için hyaloid sonraki düz montaj.
Abstract
Göz içinde, embriyonik hiyojenik damarlarda Retina damarların gelişmesinde gelişen objektif ve Retina ve gerileme besler. Hiyoid damarların kalıcı veya başarısız regresyon, kalıcı hiperplastik primer vitreus (PHPV) gibi hastalıklarda görülebilir, engel olan bir ışık yoluna ve görsel fonksiyona zarar verebilir. Hyaloid damar regresyon temel mekanizmaları anlamak vasküler regresyon sürecine yeni moleküler anlayışlar ve kalıcı hyaloid damarlarla hastalıkları yönetmek için potansiyel yeni yollar neden olabilir. Burada, optik uyum tomografi (OCT) ve fundus floresan anjiyografi (FFA) ile canlı farelerde görüntüleme hyaloidinin prosedürlerini ve nicel analiz için düz montaj hyaloid ex vivo ile izole edilen ayrıntılı bir teknik protokol açıklanmaktadır. Düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör ile ilgili protein 5 (LRP5) nakavt fareler deneysel kalıcı hyaloid damarların modeli olarak kullanılan, teknikleri göstermek için. Bu teknikler birlikte, vasküler regresyon deneysel bir model olarak hyalooid damarların kapsamlı bir değerlendirme ve kalıcı hyaloid damarların mekanizması üzerinde çalışmalar kolaylaştırabilir.
Introduction
Göz kan kaynağı Retina ve çevredeki oküler dokularda normal gelişimini sağlamak ve uygun bir görsel fonksiyon donatmak için esastır. Göz üç vasküler yatak vardır: Retina damar, koroid, ve hyaloid damarların geçici embriyonik dolaşım ağı. Oküler damar gelişimi, embriyogenit ve doku olgunlaşma boyunca uzamsal ve temporal koordinasyon gerektirir. Üç vasküler yatak arasında, hyaloid damarsal yeni oluşturulan embriyonik objektif ve gelişmekte olan Retina beslenme ve oksijen sağlamak için ilk fonksiyonel kan kaynağı sistemidir. Hyaloid damarların aynı zamanda Retina vasculatures geliştirmek ve olgun1gerileme. Hyaloid damarsal regresyon görsel fonksiyon gelişimi için net bir görsel yol sağlamak için önemli olan; Bu nedenle, bu vasküler regresyon süreci Retina damarının büyümesi kadar önemlidir. Bozulmuş hyaloid regresyon göz hastalıklarına yol açabilir. Ayrıca, hyaloid damarların regresyon vasküler regresyon düzenlenmesi dahil hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için bir model sistemi sağlar, hangi de diğer organlarda anjiyojenik düzenleme için etkileri olabilir.
Hyaloid vasküler (ha), hiyoid damarsal, Vasa hyaloidea propria (vhp), tunika vaskas lentis (TVL) ve Pupiller membran (PM) oluşur. Bu gelişen retinaya beslenme sağlar, primer vitreus, ve embriyonik gelişim sırasında objektif2. Objektif vitreus aracılığıyla ha, vhp dalları anteriora kaynaklanan. TVL bardak lens kapsülünün posterior yüzeyi, ve anterior siliyer arterlere bağlanan PM anastomozlar, objektif anterior yüzeyi kapsayan2,3, PM gemiler bir ağ oluşumu sonuçlanan 3 ‘ ü , 4 , 5. ilginçtir, hyaloid damar içinde hiçbir damarlar vardır, ve sistem venöz drenajı gerçekleştirmek için koroid damarları kullanır.
İnsan embriyo, hyaloid damar neredeyse gebelikte yaklaşık dokuzuncu hafta içinde tamamlanmış ve ilk Retina damarların ortaya çıktığında gerileme başlar, gebelik dördüncü ayında2. Vhp atrofisi ile başlayan, TVL kapiller ağları regresyon, PM, ve son olarak, ha sonradan oluşur2,3. Bu arada, primer vitreus geri çeker ve ikincil vitreus forma başlar, kollajen lifleri de dahil olmak üzere, ekstrasellüler matris bileşenleri oluşur. Gebelik altıncı ay, primer vitreus lens için optik sinir diski uzanan küçük bir şeffaf kanala azalır, Cloquet kanalı veya hyaloid kanal denilen, ve ikincil vitreus posterior segmentin ana bileşeni haline gelir 2 , 3. hyaloid sirkülasyon çoğunlukla 35 kadar kaybolur 36 gebelik hafta, sadece Doğum3önce.
Insanlardan farklı olarak, kim hyaloid damar tamamen Doğum geriledi, fare hyaloid vasküler sistem doğumdan sonra gerileme başlar. Fare retinası doğduğunda avasküler ve Retina damarlarının postnatal gün (P) 4 ‘ ten aynı anda, hyaloid damarların gerileme ve çoğunlukla tamamen P216 (Şekil 1) tarafından gerilmiş. PM ilk P10 ve P12 arasında kaybolur ve VHP P12 ve P16 arasında kaybolur, TVL ve HA hücrelerin az sayıda bile P16 kalır, ve P21 hyaloid vasküler sistem regresyon neredeyse tam6. Bu arada, Retina damar doğduktan sonra gelişmeye başlar. Vasküler pleksakın yüzeysel tabakası P7 – P8 periferik retinaya tam olarak uzanır, derin tabaka (Outer pleksiform katmanında bulunur) P7 – P12 ‘ den gelişir ve son olarak, iç pleksiform katmanındaki ara plekbe P12 ile P15 7 arasında gelişir. . Retina damar gelişimi geliştikçe, gelişen gözle beslenmeyi ve oksijeni sağlayan hyalüroid damarların giderek gerilmesi fonksiyonunun yerini alır. Fareler içinde hyaloid damar regresyon postnatal oluşumu gözlemlemek ve hyaloid damarsal çalışma, hem fizyolojik ve altında vasküler regresyon süreçleri yöneten moleküler temelinde bir kolay erişilebilir deneysel model sağlar patolojik koşullar8.
Hyalüroid regresyon yetmezliği, embriyolojik, primer vitreus ve hyaloid damarsal9‘ da başarısız veya tamamlanmamış bir regresyon kaynaklanan göz nadir konjenital gelişimsel anomali olan PHPV gibi hastalıklarda görülebilir. Hyalüroid damarsal regresyon sürecini düzenleyen mekanizmalar karmaşık ve geniş bir şekilde incelenmiştir. Hiyoid damarların normal regresyon için gerekli olan bir büyük moleküler yol WNT sinyalizasyon yolu10, bu yol hem WNT ligand ve reseptörleri etkileyen genetik mutasyonlar Insanlar PHPV ile bağlantılı olduğu gibi9. Deneysel çalışmalar bir WNT ligand, Wnt7b, bu regresyon süreci aracılık için gelişmekte olan göz hyaloid damarların etrafında makrofajlar tarafından üretilen tespit. Wnt7b reseptörleri ile bağlama tarafından WNT sinyalizasyon etkinleştirir frizzled4 (FZD4)/LRP5 hücre apoptozis başlatmak için bitişik endotel hücrelerde, hyaloid damarların regresyon önde gelen10. Sonuç olarak, Wnt7b-eksikliği fareler hyaloid damarların bir kalıcılık göstermek10. Benzer şekilde, geleneksel olmayan bir WNT ligand, Norrin ( NDP geni ile kodlanmış), aynı zamanda FZD4/LRP5, geliştirme sırasında hyaloid damar regresyon neden bağlanır. NDPy/-, Lrp5-/-, ve Fzd4-/- fareler tüm ekran ertelendi hyaloid damar regresyon, WNT sinyalizasyon kritik bir düzenleyici rolünü destekleyen11,12, 13,14,15,16. Dahası, başka bir WNT coreceptor LRP6 hyaloid vasküler endotel hücrelerde WNT sinyalizasyon yolu modüle üzerindeki işlevlerinde LRP5 ile çakışıyor17. Hyaloid regresyon için de katkı sağlayan diğer faktörler arasında hypoxia-indüklenebilir faktör18,19, vasküler endotel büyüme faktörü20,21, kollajen-1822, 23, ARF24, angiopoietin-225, ve kemik morfogenetik protein-426. Bu yazıda, hiyoid damarların hem in vivo hem de ex vivo yöntemlerle değerlendirilmesi ve karakterize edilmesi tekniklerini göstermek için Lrp5-/- Mice ‘ i kalıcı hyalüroid damar modeli olarak kullanıyoruz.
Hyaloid damarsal in vivo ve ex vivo görselleştirme Hiyoid damar regresyon mekanizmaları incelemek için gereklidir. Hyaloid damarsal gözlemlemek için geçerli yöntemler özellikle görselleştirme ve VHP ve HA analiz odaklanmak, OCT ve FFA görüntüleri aracılığıyla, göz çapraz bölümler, ve hyaloid düz montaj. OCT ve FFA güçlü içinde vivo görüntüleme araçları, onlar gözlerini açtıktan sonra canlı hayvanların boyuna gözlem sağlar. Dahası, izole hyaloid düz montaj tüm hyaloid damar ölçünün görselleştirilmesini ve gemi numaralarının doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamak için bir araç sağlar. Henüz hyaloid damarların hassas ve kırılgan doğası ve izolasyonlarının ortaya çıkan teknik zorluklarının göz araştırmalarında kullanımı biraz10,17,27sınırlı olabilir. Bu yazıda, bu tekniklerin fizibilitesini geliştirmek için hem in vivo canlı retina görüntüleme hem de ex vivo izole hyaloid düz montajı birleştiren hyaloid damarların görselleştirmesinde ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Bu protokol, Live fundus ve OCT Imaging28 ‘ in In vivo yöntemi ve yalıtılmış hyaloid Flat Mount11‘ in ex vivo yöntemi ile önceki yayınlardan değişiklik ve genişleme ile adapte edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hiyoid damarların değerlendirilmesi ve karakterize edilmesi teknikleri, geliştirme sırasında vasküler regresyon temel mekanizmaları üzerinde çalışmalar sağlamak için, hayvansal modellerde hyaloid damar regresyon gözlemlemek için sezgisel ve gerekli prosedürler vardır. In vivo Retina Görüntüleme aynı hayvan içinde hyaloid regresyon uzunlamasına gözlem sağlar iken, OCT ve FFA için bir kemirgen fundus görüntüleme sistemine erişim sınırlayıcı bir faktör olabilir. Ayrıca, canlı fareler iç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, National Institutes of Health (NıH) hibe (R01 EY024963 ve EY028100) için JC Z.W. tarafından desteklenen bir Knights Templar göz Vakfı kariyer Starter Grant tarafından desteklenmektedir. Bu çalışmada açıklanan hyaloid yalıtım prosedürü, yazarların minnettar olduğu DRS. Richard Lang, Toshihide Kurihara ve Lois Smith tarafından cömertçe paylaşılan protokollerden değişiklik ile adapte edildi.
Materials
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
References
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. , (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Saint-Geniez, M., D’Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
