Beoordeling en karakterisering van Hyaloïde vaten bij muizen
Summary
Dit protocol beschrijft zowel in vivo-als ex vivo-methoden om hyaloïde vaten volledig te visualiseren en karakteriseren, een model van vasculaire regressie in muis ogen, met behulp van optische coherentie tomografie en fundus fluoresceïne angiografie voor de Live Imaging en ex vivo isolatie en daaropvolgende vlakke houder van hyaloïde voor kwantitatieve analyse.
Abstract
In het oog voeden de embryonale hyaloïde vaten de ontwikkelende lens en het netvlies en regressie wanneer de retinale bloedvaten zich ontwikkelen. Aanhoudende of mislukte regressie van hyaloïde vaten kan worden gezien bij ziekten zoals persistent hyperplastische primair glasvocht (PHPV), wat leidt tot een belemmerd lichtpad en een verminderde visuele functie. Inzicht in de onderliggende mechanismen van de hyaloïde bloedvat regressie kan leiden tot nieuwe moleculaire inzichten in het vasculaire regressie proces en potentiële nieuwe manieren om ziekten met aanhoudende hyaloïde vaten te beheersen. Hier beschrijven we de procedures voor het beeldvormende mellitus in levende muizen met optische coherentie tomografie (OCT) en fundus fluoresceïne angiografie (FFA) en een gedetailleerd technisch protocol van isolerende en platte mellitus ex vivo voor kwantitatieve analyse. Low-density lipoproteïne receptor-gerelateerde proteïne 5 (LRP5) Knockout muizen werden gebruikt als een experimenteel model van aanhoudende hyaloïde vaten, ter illustratie van de technieken. Samen kunnen deze technieken een grondige beoordeling van hyaloïde vaten mogelijk maken als een experimenteel model van vasculaire regressie en studies over het mechanisme van aanhoudende hyaloïde vaten.
Introduction
De bloedtoevoer in het oog is essentieel om de normale ontwikkeling van het netvlies en de omringende oculaire weefsels te waarborgen en een goede visuele functie uit te rusten. Er zijn drie vasculaire bedden in het oog: de retinale vasculatuur, de choroid en een voorbijgaande embryonale circulatie netwerk van hyaloïde vaten. De ontwikkeling van de oculaire vasculatuur vereist ruimtelijke en temporele coördinatie in de gehele embryogenese en weefsel rijping. Onder de drie vasculaire bedden is de mellitus vasculatuur het eerste functionele bloedtoevoer systeem dat voeding en zuurstof levert aan de nieuw gevormde embryonale lens en het ontwikkelende netvlies. Hyaloïde vaten regressie op hetzelfde moment dat de retina vasculaturen ontwikkelen en volwassen1. De regressie van hyaloïde vasculatuur is cruciaal om een duidelijk visueel traject voor de ontwikkeling van visuele functie mogelijk te maken; Vandaar, dit vasculaire regressie proces is net zo belangrijk als de groei van retinale vasculatuur. Verminderde hyaloïde regressie kan leiden tot oogziekten. Bovendien biedt de regressie van hyaloïde vaten een modelsysteem om de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij de regulering van vasculaire regressie, wat gevolgen kan hebben voor de angiogene regulatie in andere organen ook.
De hyaloïde vasculatuur, afgeleid van de hyaloïde slagader (ha), bestaat uit Vasa hyaloidea propria (VHP), Tunica vasculosa linzen (TVL) en pupil membraan (PM). Het biedt voeding aan de ontwikkelende retina, de primaire glasvocht, en de lens tijdens de embryonale ontwikkeling2. Als gevolg van de HA worden de VHP takken door het glasvocht naar de lens. De TVL cups het achterste oppervlak van de lens capsule, en anastomosen aan de PM, die aansluit op de voorste Ciliaire slagaders, die het voorste oppervlak van de lens2,3, resulterend in de vorming van een netwerk van schepen in de PM 3 , 4 , 5. interessant is dat er geen aderen in de hyaloïde vasculatuur zijn, en het systeem maakt gebruik van choroïdale aderen om veneuze drainage te bereiken.
In het menselijk embryo is de hyaloïde vasculatuur bijna voltooid bij ongeveer de negende week van de dracht en begint te regeren wanneer de eerste retinale vaten verschijnen, tijdens de vierde maand van de dracht2. Beginnend met atrofie van de VHP, regressie van de capillaire netwerken van de TVL, de PM, en ten slotte, de ha treedt vervolgens op2,3. Ondertussen trekt het primaire glasvocht in en de secundaire glasvocht begint te vormen, samengesteld uit de extracellulaire matrix componenten, waaronder collageenvezels. Door de zesde maand van de dracht wordt het primaire glasvocht gereduceerd tot een klein transparant kanaal dat zich uitstrekt van de oogzenuw schijf naar de lens, het Cloquet’s kanaal of het hyaloïde kanaal, en het secundaire glasvocht wordt het hoofdbestanddeel van het posterieure segment 2 , 3. de hyaloïde circulatie verdwijnt meestal op 35 tot 36 weken van de dracht, net voor de geboorte3.
In tegenstelling tot mensen, bij wie hyaloïde vasculatuur volledig achteruit is bij de geboorte, begint het hyaloïde vasculaire systeem van de muis na de geboorte te vervallen. Naarmate het netvlies van de muis wordt geboren, worden avasculaire en retinale bloedvaten postnataal ontwikkeld, hyaloïde vaten komen gelijktijdig uit postnatale dag (P) 4 en zijn meestal volledig achteruit gaan door P216 (Figuur 1). De PM verdwijnt eerst tussen P10 en P12, en de VHP verdwijnt tussen P12 en P16, terwijl een klein aantal TVL-en ha-cellen zelfs bij P16 blijft, en door P21 de mellitus-vasculaire systeem regressie is bijna voltooid6. In de tussentijd begint retinale vasculatuur na de geboorte te ontwikkelen. De oppervlakkige laag van vasculaire plexus strekt zich volledig uit tot de perifere Retina bij P7-P8, de diepe laag (gelegen in de buitenste plexiforme laag) ontwikkelt van P7 – P12, en ten slotte ontwikkelt de tussenliggende plexus in de binnenste plexiforme laag tussen P12 en P157 . Naarmate de retinale vasculatuur zich ontwikkelt, vervangt deze geleidelijk de functie van gelijktijdig regressiehoudende hyaloïde vaten, waardoor voeding en zuurstof aan het ontwikkelende oog worden verstrekt. Het postnatale optreden van hyaloïde bloedvat regressie in muizen biedt een gemakkelijk toegankelijk experimenteel model om de hyaloïde vasculatuur te observeren en te bestuderen, evenals de moleculaire basis voor vasculaire regressie processen onder zowel fysiologische als pathologische condities8.
Falen van hyaloïde regressie kan worden gezien bij ziekten zoals PHPV, wat een zeldzame aangeboren ontwikkelings anomalie van het oog is, resulterend uit een mislukte of onvolledige regressie van de embryologische, primaire glasvocht en hyaloïde vasculatuur9. De mechanismen die het regressie proces van hyaloïde vasculatuur reguleren zijn ingewikkeld en breed bestudeerd. Een belangrijk moleculair traject essentieel voor de normale regressie van hyaloïde vaten is de Wnt signalering traject10, als genetische mutaties in dit traject beïnvloeden zowel WNT ligand en receptoren zijn gekoppeld met phpv bij de mens9. Experimentele studies identificeerden een WNT ligand, Wnt7b, die wordt geproduceerd door macrofagen rond hyaloïde vaten in de ontwikkelende ogen te bemiddel dit regressie proces. Wnt7b activeert WNT-signalering door binding met de receptoren frizzled4 (FZD4)/LRP5 in aangrenzende endotheliale cellen om cel apoptosis te initiëren, wat leidt tot de regressie van hyaloïde vaten10. Dientengevolge, Wnt7b-deficiënte muizen tonen een persistentie van hyaloïde schepen10. Evenzo bindt een niet-conventionele WNT ligand, NorriN (gecodeerd door het NDP -gen), ook aan FZD4/LRP5 om de mellitus-bloedvat regressie tijdens de ontwikkeling te induceren. NDPy/-, Lrp5-/-, en Fzd4-/- muizen alle weergeven uitgesteld mellitus vessel regressie, ondersteuning van een cruciale regelgevende rol van WNT signalering11,12, 13,14,15,16. Bovendien, een andere WNT coreceptor LRP6 overlapt met LRP5 in hun functie op het moduleren van de Wnt signalering traject in mellitus vasculaire endotheliale cellen17. Andere factoren die ook kunnen bijdragen aan de hyaloïde regressie omvatten de hypoxie-induciblefactor 18,19, vasculaire endotheliale groeifactor 20,21, collageen-1822, 23, ARF24, angiopoietin-225, en botmorfogenetisch eiwit-426. In dit artikel gebruiken we Lrp5-/- muizen als een model van hardnekkige hyaloïde vaten om de technieken van het beoordelen en karakteriseren van hyaloïde vasculatuur door zowel in vivo als ex vivo-methoden aan te tonen.
De visualisatie van mellitus vasculatuur in vivo en ex vivo is essentieel voor het bestuderen van de mechanismen van mellitus-bloedvat regressie. De huidige methoden voor het observeren van hyaloïde vasculatuur richten zich vooral op het visualiseren en analyseren van de VHP en ha, door middel van Oct-en FFA-beelden, oogdwars secties en de mellitus-vlakke bevestiging. OCT en FFA zijn krachtige in vivo beeldvormings hulpmiddelen, waardoor longitudinale observatie in levende dieren mogelijk wordt nadat ze hun ogen hebben geopend. Bovendien biedt geïsoleerde hyaloïde platte steun een visualisatie van de gehele mellitus-vasculatuur en een middel om een nauwkeurige kwantificering van de vaartuig nummers te bereiken. Toch kan de delicate en fragiele aard van de hyaloïde schepen en de daaruit voortvloeiende technische moeilijkheden van zijn isolement het gebruik ervan in oogonderzoek enigszins10,17,27hebben beperkt. In dit artikel bieden we een gedetailleerd protocol van de visualisatie van hyaloïde vaten, waarbij zowel in vivo levende retinale beeldvorming als ex vivo geïsoleerde hyaloïde platte steun wordt gecombineerd om de haalbaarheid van deze technieken te verbeteren. Dit protocol is aangepast met aanpassing en uitbreiding van eerdere publicaties over de in vivo-methode van Live fundus en OCT Imaging28 en de ex vivo-methode van geïsoleerde hyaloïde platte Mount11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Technieken voor het beoordelen en karakteriseren van hyaloïde schepen zijn intuïtieve en noodzakelijke procedures om de mellitus-bloedvat regressie in diermodellen te observeren, om studies mogelijk te maken over de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vasculaire regressie tijdens de ontwikkeling. Terwijl de in vivo retinale beeldvorming de longitudinale observatie van hyaloïde regressie in hetzelfde dier toestaat, kan de toegang tot een knaagdier fundus Imaging System voor OCT en FFA een beperkende factor zijn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health (NIH) subsidies (R01 EY024963 en EY028100) aan J.C. Z.W. werd gesteund door een Knights Templar Eye Foundation Career starter subsidie. De hyaloïde isolatie procedure beschreven in deze studie werd aangepast met modificatie van protocollen royaal gedeeld door drs. Richard lang, Toshihide Kurihara, en Lois Smith, aan wie de auteurs zijn dankbaar.
Materials
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
References
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. , (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Saint-Geniez, M., D’Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
