Evaluación y caracterización de recipientes hialoides en ratones
Summary
Este protocolo describe métodos in vivo y ex vivo para visualizar y caracterizar completamente los vasos hialoide, un modelo de regresión vascular en los ojos del ratón, utilizando tomografía de coherencia óptica y angiografía de fundus fluoresceina para la imagen en vivo y ex vivo aislamiento y posterior montaje plano del hialoides para el análisis cuantitativo.
Abstract
En el ojo, los vasos hialoides embrionarios nutren la lente en desarrollo y la retina y retroceden cuando se desarrollan los vasos retinianos. La regresión persistente o fallida de los vasos hialoidese se puede ver en enfermedades como el vítreo primario hiperplásico persistente (PHPV), lo que conduce a una trayectoria de luz obstruida y a una función visual deteriorada. Comprender los mecanismos subyacentes a la regresión del vaso hialoide puede conducir a nuevas perspectivas moleculares sobre el proceso de regresión vascular y posibles nuevas formas de manejar enfermedades con vasos hialoides persistentes. Aquí describimos los procedimientos para la toma de imágenes de hialoide en ratones vivos con tomografía de coherencia óptica (OCT) y angiografía de fundus fluoresceína (FFA) y un protocolo técnico detallado de aislar y montar hialoide ex vivo para análisis cuantitativo. Los ratones noqueadores relacionados con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 5 (LRP5) se utilizaron como modelo experimental de vasos hialoide persistentes, para ilustrar las técnicas. Juntos, estas técnicas pueden facilitar una evaluación exhaustiva de los vasos hialoides como un modelo experimental de regresión vascular y estudios sobre el mecanismo de los vasos hiloide persistentes.
Introduction
El suministro de sangre en el ojo es esencial para asegurar el desarrollo normal de la retina y los tejidos oculares circundantes y para equipar una función visual adecuada. Hay tres camas vasculares en el ojo: la vasculatura de la retina, la coroides y una red circulatoria embrionaria transitoria de vasos hialoides. El desarrollo de la vasculatura ocular requiere coordinación espacial y temporal a lo largo de la embriogénesis y la maduración de tejidos. Entre las tres camas vasculares, la vasculatura hialoide es el primer sistema funcional de suministro de sangre que proporciona nutrición y oxígeno a la lente embrionaria recién formada y la retina en desarrollo. Los vasos hialoides retroceden al mismo tiempo que las vasculaturas de la retina se desarrollan y maduran1. La regresión de la vasculatura hialoide es fundamental para permitir una vía visual clara para el desarrollo de la función visual; por lo tanto, este proceso de regresión vascular es tan importante como el crecimiento de la vasculatura de la retina. La regresión hialide deteriorada puede conducir a enfermedades oculares. Además, la regresión de los vasos hialoides proporciona un sistema modelo para investigar los mecanismos celulares y moleculares involucrados en la regulación de la regresión vascular, que puede tener implicaciones para la regulación angiogénica en otros órganos también.
La vasculatura hialoide, derivada de la arteria hiloide (HA), se compone de vasa hyaloidea propria (VHP), tunica vasculosa lentis (TVL), y membrana pupilar (PM). Proporciona nutrición a la retina en desarrollo, el vítreoprimario y la lente durante el desarrollo embrionario 2. A partir de la HA, VHP se ramifica anteriormente a través del vítreo a la lente. El TVL copa la superficie posterior de la cápsula de la lente, y anastomosas a la PM, que se conecta a las arterias ciliares anteriores, cubriendo la superficie anterior de la lente2,3, lo que resulta en la formación de una red de vasos en el PM 3 , 4 , 5. Curiosamente, no hay venas en la vasculatura hialoides, y el sistema hace uso de venas coroidas para lograr el drenaje venoso.
En el embrión humano, la vasculatura hialoide está casi completa aproximadamente a la novena semana de gestación ycomienza a retroceder cuando aparecen los primeros vasos retinianos, durante el cuarto mes de gestación 2. Comenzando con la atrofia del VHP, regresión de las redes capilares dela TVL, el PM, y por último, la HA se produce posteriormente 2,3. Mientras tanto, el vítreo primario se retrae y el vítreo secundario comienza a formarse, compuesto por los componentes de la matriz extracelular, incluyendo fibras de colágeno. Para el sexto mes de gestación, el vítreo primario se reduce a un pequeño canal transparente que se extiende desde el disco nervioso óptico hasta la lente, llamado canal o canal hiloide del Cloquet, y el vítreo secundario se convierte en el componente principal del segmento posterior 2 , 3. La circulación hialoides desaparece sobre todo a 35 a 36 semanas de gestación, justo antes del nacimiento3.
A diferencia de los seres humanos, en los que la vasculatura hialoide está completamente regresiva al nacer, el sistema vascular hialoide del ratón comienza a retroceder después del nacimiento. A medida que la retina del ratón nace avascular y los vasos retinianos se desarrollan postnatalmente, los vasos hialoides retroceden simultáneamente desde el día postnatal (P) 4 y son en su mayoría completamente regresivos por P216 (Figura1). El PM desaparece primero entre P10 y P12, y el VHP desaparece entre P12 y P16, mientras que un pequeño número de células TVL yHA permanecen incluso en P16, y para P21 la regresión del sistema vascular hialoide es casi completa 6. Mientras tanto, la vasculatura de la retina comienza a desarrollarse después del nacimiento. La capa superficial del plexo vascular se extiende completamente a la retina periférica en P7–P8, la capa profunda (ubicada en la capa plexiforme externa) se desarrolla a partir de P7–P12, y finalmente, el plexo intermedio en la capa plexiforme interna se desarrolla entre P12 y P157 . A medida que se desarrolla la vasculatura de la retina, reemplaza gradualmente la función de retroceder concomitantemente los vasos hialoides, proporcionando nutrición y oxígeno al ojo en desarrollo. La ocurrencia postnatal de la regresión del vaso hialoide en ratones proporciona un modelo experimental de fácil acceso para observar y estudiar la vasculatura hialoides, así como la base molecular que rige los procesos de regresión vascular bajo la condiciones patológicas8.
El fracaso de la regresión hialoides se puede ver en enfermedades como el PHPV, que es una rara anomalía congénita del desarrollo del ojo resultante deuna regresión fallida o incompleta de la vasculatura embrionaria, vítrea primaria e hialoides 9. Los mecanismos que regulan el proceso de regresión de la vasculatura hialoides son complicados y ampliamente estudiados. Una vía molecular importante esencial para la regresión normal de los vasos hialoides es la vía de señalización Wnt10,yaque las mutaciones genéticas en esta vía que afectan tanto al ligando Wnt como a los receptores se han relacionado con el VPH en los seres humanos 9. Estudios experimentales identificaron un ligando Wnt, Wnt7b, que es producido por macrófagos alrededor de los vasos hialoides en el ojo en desarrollo para mediar este proceso de regresión. Wnt7b activa la señalización Wnt mediante la unión con los receptores frizzled4 (FZD4)/LRP5 en células endoteliales adyacentes para iniciar la apoptosis celular, lo que conduce a la regresión de los vasos hialoides10. Como resultado, los ratones Wnt7b-deficientes muestran una persistencia de los vasos hialoide10. Del mismo modo, un ligando Wnt no convencional, Norrin (codificado por el gen Ndp), también se une a FZD4/LRP5 para inducir la regresión del vaso hiloide durante el desarrollo. Los ratones Ndpy/-, Lrp5-/-y Fzd4-/- muestran regresión pospuesta del recipiente hiloide, apoyando un papel regulador crítico de la señalización Wnt11,12, 13,14,15,16. Por otra parte, otro coreceptor Wnt LRP6 se superpone con LRP5 en su función de modulación de la vía de señalización Wnt en células endoteliales vasculares hialoide17. Otros factores que también pueden contribuir a la regresión hialoide incluyen el factor hipoxia-inducible18,19, factor de crecimiento endotelial vascular20,21, colágeno-1822, 23, Arf24, angiopoietin-225, y proteína morfogenética ósea-426. En este artículo, utilizamos ratones Lrp5-/- como modelo de vasos hialoide persistentes para demostrar las técnicas de evaluación y caracterización de la vasculatura hialoides a través de métodos in vivo y ex vivo.
La visualización de la vasculatura hialoide in vivo y ex vivo es esencial para estudiar los mecanismos de regresión de los vasos hialoides. Los métodos actuales para observar la vasculatura hialoide se centran principalmente en visualizar y analizar el VHP y HA, a través de imágenes OCT y FFA, secciones transversales oculares y el montaje plano hialoide. OCT y FFA son potentes herramientas de imagen in vivo, que permiten la observación longitudinal en animales vivos después de que han abierto los ojos. Además, el montaje plano hialoide aislado proporciona la visualización de toda la vasculatura hialoide y un medio para lograr una cuantificación precisa del número de recipientes. Sin embargo, la naturaleza delicada y frágil de los vasos hialoidey y las dificultades técnicas resultantes de su aislamiento pueden haber limitado su uso en la investigación ocular un poco10,17,27. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado de la visualización de vasos hialoides, combinando imágenes retinianas en vivo in vivo y montaje plano hialoide aislado ex vivo para mejorar la viabilidad de estas técnicas. Este protocolo ha sido adaptado con la modificación y ampliación de publicaciones anteriores sobre el método in vivo de fondo en vivo y pTU imagen28 y el método ex vivo de montaje plano hialoide aislado11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las técnicas para evaluar y caracterizar los vasos hialoides son procedimientos intuitivos y necesarios para observar la regresión del vaso hialoide en modelos animales, para permitir estudios sobre los mecanismos subyacentes a la regresión vascular durante el desarrollo. Si bien la imagen retiniana in vivo permite la observación longitudinal de la regresión hialoides en el mismo animal, el acceso a un sistema de imágenes de fondos para roedores para LA OCT y la FFA puede ser un factor limitante. Además, la toma d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las becas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (R01 EY024963 y EY028100) a J.C. Z.W. contó con el apoyo de una beca de iniciación profesional de la Knights Templar Eye Foundation. El procedimiento de aislamiento hialoide descrito en este estudio fue adaptado con la modificación de protocolos generosamente compartidos por los doctores Richard Lang, Toshihide Kurihara y Lois Smith, a quienes los autores están agradecidos.
Materials
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
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