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방법 논문

대류 온라인 MRI 이미지의 지도하에 Rhesus Macaque의 피질에 광유전학 아데노 관련 바이러스 벡터의 향상된 납품

6.6K 조회수

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DOI:

10.3791/59232

⸱

2019년 5월 23일

 ,  ,  , 
1Departments of Bioengineering, University of Washington, 2Washington National Primate Research Center, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Washington, 4Department of Physiology and Center for Integrative Neuroscience, University of California, San Francisco

교신 저자: Azadeh Yazdan-Shahmorad <azadehy@uw.edu>

이 논문에서

요약

여기에서, 우리는 마카크 두뇌에 있는 큰 피질 지역에 걸쳐 광유전학적 표현을 달성하기 위한 효율적이고 간단한 접근으로 피질로 바이러스 벡터의 자기 공명 (MR) 유도된 대류 강화한 납품 (CED)를 보여줍니다.

초록

비 인간 영장류 (NHP) 광유전학에서, 바이러스 성 벡터로 큰 피질 영역을 감염하는 것은 종종 어렵고 시간이 많이 걸리는 작업입니다. 여기에서, 우리는 1 차적인 체감각 (S1) 및 모터 (M1) 원숭이의 피질 피질 로 광유전학 적 바이러스 벡터의 자기 공명 (MR) 유도 대류 강화 전달 (CED)의 사용을 입증하여 효율적이고 광범위한 피질 발현을 얻습니다. 빛에 민감한 이온 채널. 황색 형광 단백질(EYFP)에 융합된 적색 이동 opsin C1V1을 코딩하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 MR-유도 CED 하에서 코막강 마카크의 피질내로 주입되었다. 3개월 후 주입 후, 에피인광 이미징은 2개의 원숭이에서 M1 및S1에서 광유전학적 발현(>130 mm2)의 큰 영역을 확인하였다. 또한, 마이크로 전기 코르티코그래피 어레이를 사용하여 표현 영역에서 신뢰할 수 있는 빛을 불러일으킨 전기 생리학적 반응을 기록할 수 있었습니다. 나중에 리포터에 대한 조직학적 분석 및 면역 염색은 후피광성 이미징에 의해 지시된 분포에 대응하는 M1 및 S1에서 광범위하고 조밀한 광유전학적 발현을 밝혀냈다. 이 기술은 우리가 전통적인 기술에 비해 최소한의 손상으로 시간의 짧은 기간 내에 피질의 넓은 영역에 걸쳐 발현을 얻을 수 있게 하고 NHPs와 같은 큰 동물에 있는 광유전학 바이러스성 납품을 위한 최적 접근일 수 있습니다. 이 접근법은 인간과 진화적으로 가까운 동물 모델에서 세포 유형 특이성을 가진 신경 회로의 네트워크 수준 조작에 대한 큰 잠재력을 보여줍니다.

서론

광유전학은 신경 활동의 조작과 뇌의 네트워크 연결 연구를 허용하는 강력한 도구입니다. 비 인간 영장류에서이 기술을 구현 (NHPs) 대규모 신경 계산의 우리의 이해를 향상 시킬 가능성이 있다, 인식, 그리고 영장류 두뇌에 행동. 광유전학이 최근 몇 년 동안 NHP에서성공적으로 구현되었지만 1, 2,3,4,5,6,7, 연구원 얼굴은 이 동물에 있는 큰 두뇌 지역에 걸쳐 표현의 상부를 달성하고 있습니다. 여기에서, 우리는 원숭이에 있는 피질의 넓은 지역에 걸쳐 광유전학 표현의 상부를 달성하기 위하여 능률적이고 간단한 접근을 제공하고 있습니다. 이 기술은 최첨단 기록8,9 및 광학 자극10 기술과 함께 이러한 동물의 현재 광유전학 연구를 향상시킬 수있는 큰 잠재력을 가지고있다.

대류 강화 전달(CED)은 바이러스 벡터를 포함하는 약리작용제 및 기타 큰 분자를 중추신경계(11,12,13)로전달하는 확립된 방법이다. 기존의 전달 방법은 뇌의 작은 영역에 분산 된 여러 낮은 볼륨 주입을 포함하는 반면, CED는 적은 주입으로 더 광범위하고 균일 한 에이전트 분포를 달성 할 수 있습니다. 주입 중 압력 구동 벌크 유체 흐름 (대류)은 CED를 가진 바이러스 성 벡터를 전달할 때 표적 조직의 보다 광범위하고 균일하게 분포된 전달을 허용합니다. 최근 연구에서, 우리는 자기 공명 (MR) 유도 CED를 사용하여 1 차 모터 (M1) 및 체감각 (S1) 코르티즘9 및 시상14의 넓은 영역의 형질 전환 및 후속 광유전학 적 발현을 입증했다.

여기에서, 우리는 단지 몇몇 피질 주사를 가진 큰 피질 지역에 걸쳐 광유전학적인 표현을 달성하기 위하여 CED의 사용을 설명합니다.

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프로토콜

모든 절차는 캘리포니아 대학, 샌프란시스코 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수합니다. 다음 의 절차는 각각 17.5 kg 및 16.5 kg (원숭이 G 및 원숭이 J)의 무게, 8 및 7 세의 성인 남성 rhesus 원숭이 2 개를 사용하여 수행되었다.

참고: 모든 수술에 표준 무균 기술을 사용하십시오.

1. 기준선 이미징

  1. 동물을 진정시키고 삽관하고 이소플루란 하에서 전신 마취를 유지하십시오 (호흡률 및 심박수와 같은 활력 징후에 따라 필요에 따라 농도가 0에서 5 % 사이로 변경됩니다). 절차 전반에 걸쳐 동물의 온도, 심박수, 산소 포화도, 심전도 반응 및 CO2의 말조 부분 압력을 모니터링합니다.
  2. 동물을 MR 호환 입체 프레임(재료 표참조)에 놓고 이 프레임은 절차 전체에 걸쳐 유지됩니다. 동물을 휴대용 MR 호환 isoflurane 기계에 연결하고 MRI 스캐너 (3 T)로 운반하십시오.
  3. 표준 T1(플립 각도 = 9°, 반복 시간/에코 시간 = 668.6, 매트릭스 크기 = 192 x 192 x 80, 슬라이스 두께 = 1mm) 및 T2(플립 각도 = 1mm), 반복 시간/에코 시간 = 52.5, 매트릭스 크기 = 256 x 256 x 45, 슬라이스 두께 = 1mm) 해부학 MR 이미지 참조 및 수술 계획에 대한.
  4. 마취에서 동물을 복구하고 동물 수용 지역으로 수송.
  5. 획득한 T1 및 T2 이미지를 사용하여 개두량의 배치를 결정합니다. 개두술의 위치는 마카크 뇌 아틀라스 (Paxinos, 황, 페트리드, 토가 2nd Edition)와 MR의 관심있는 피질 영역을 일치시킴으로써 정확하게 결정될 수 있습니다. 또한, 이들 기준선은 바이러스 주입의 위치에 대한 추정치를 제공할 수 있다. 여기서 입증된 피질 영역은 M1 및 S1입니다.

2. MR 호환 챔버 이식

  1. 동물을 진정시키고 삽관하고 1.1에서와 같이 표준 마취 모니터링으로 전신 마취를 유지하십시오.
  2. 동물을 MR 호환 입체 프레임에 놓고 챔버 이식 및 바이러스 벡터 전달 전반에 걸쳐 유지됩니다. 동물을 휴대용 MR 호환 이소플루란 기계에 연결합니다.
  3. 메스로 약 5cm의 길이로 중간선에서 약 2cm 의 시상 절개를 만듭니다.
  4. 엘리베이터를 사용하여 두개골에서 기본 연조직을 제거합니다(재료 표참조).
  5. 트레핀을 사용하여 주사를 위해 미리 계획된 궤적을 덮기 위해 원형 개두술(직경 2.5cm)을 만듭니다(재료 표참조).
    1. 트레핀의 가장자리를 지나 트레핀의 중심점을 낮춥습니다. 계획된 두개골 절제술의 중심에 트레핀의 조정 가능한 중심점을 사용하여 트레핀을 고정시키기에 충분히 깊은 두개골의 중심에 들여쓰기를 만듭니다. 이 기본 신경 조직에 손상을 일으킬 수 있기 때문에 완전히 두개골의 깊이 통해 침투 하지 않도록 주의 운동.
    2. 개두술 전반에 걸쳐 조직 수분을 유지하기 위해 필요에 따라 주기적으로 식염수로 영역을 세척하십시오.
    3. 중심이 만들어지면, 트레핀을 두개골에 내리고 트레핀을 시계 방향으로 반시계 방향으로 돌리면서 뼈 캡을 집게로 제거할 수 있을 때까지 하향 압력을 가합니다. 트레핀으로 기본 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오.
  6. 개두술의 중심에있는 경막을 통해 미세 봉합사 (크기 6-0)를 스레드하고 개두량의 중심에 텐트를 만드는 뇌의 표면에서 봉합사를 부드럽게 당겨 dura를 들어 올립니다.
  7. 다음으로, 뇌손상을 피하기 위해 미세한 안과 가위를 사용하여 텐트 중앙에 가까운 경막을 뚫습니다. 그런 다음 개두술의 가장자리중앙에서 경막경을 잘라 내고 미세한 옵티마이드 가위로 가장자리를 따라 계속합니다.
  8. 원통형 맞춤형 CED MR 호환 챔버(도1참조, 생산 지침 섹션 4 참조)를 두개골 상단에 두개골 위에 장착하여 CED 주입 시 캐뉼라 지지대를 제공하여 챔버 플랜지의 곡률이 정렬되도록 합니다. 두개골의 곡률과 잘.
  9. 플라스틱 나사와 치과 용 아크릴 또는 몇 개의 티타늄 나사를 사용하여 임플란트를 두개골에 고정하십시오.

3. 바이러스 벡터 전달

  1. MR 호환 챔버를 이식하고 캐뉼라 주사 그리드(그림1A-B, 보조 도1)를 챔버에 삽입한 직후, MR 해부학 적 이미지를 통해 주사 위치를 시각화하기 위한 식염수(0.9% NaCl)로 그리드를 채우고 뇌의 수분을 유지하기 위해 젖은 멸균 흡수 성 젤라틴으로 챔버 캐비티를 채웁니다 (그림1F).
  2. 운반 및 MR 주입 중에 실린더의 멸균성을 유지하기 위해 멸균 항균 절개 드레이크로 피부와 실린더를 덮습니다. 양성 식별을 위해 사출 그리드의 상단을 표시하기 위해 비타민 E 캡슐을 놓습니다.
  3. 동물이 삽관된 채로 남아 있는 동안, 마취 회로에서 endotracheal 관을 분리하고 휴대용 MR 호환 이소플루란 기계에 다시 붙이고 MRI 스캐너에 동물을 수송합니다.
  4. T1 이미지(플립 각도 = 9°, 반복 시간/에코 시간 = 668.6, 매트릭스 크기 = 192 x 192, 슬라이스 두께 = 1mm, 80슬라이스)를 획득하여 사출 그리드와 피질 표면의 상단으로부터의 거리를 계산합니다. 비타민 E 캡슐은 T1 이미지에서 명확하게 볼 수 있으며 사출 그리드의상단에 대한 마커로 사용되어야합니다 (그림 2A). MR 이미징 소프트웨어의 눈금자 도구를 사용하여 사출 그리드의 상단과 피질 표면 사이의 거리를 측정합니다.
  5. T2 이미지(플립 각도 = 130°, 반복 시간/에코 시간 = 52.5, 매트릭스 크기 = 256 x 256, 슬라이스 두께 = 1mm, 45슬라이스)를 획득하여 대상 주입 부위를 기준으로 각 사이트에 대한 최적의 캐뉼라 가이드를 결정합니다(그림2B-C). 앞에서 언급했듯이 캐뉼라 그리드는 T2 이미지에서 가장 잘 보이는 식염수로 채워져 있습니다. MR 이미징 소프트웨어를 사용하여 관상 및 시상 평면을 스크롤하여 주입의 대상 위치를 찾습니다.
  6. 실온에서 몇 시간 동안 바이러스 벡터를 해동한 후, 바이러스 벡터를 MR 조영제 가도테리돌(250:1; 2mM Gd-DTPA 의 비율, 재료표참조)과 파이펫 또는 와류 혼합에 의해 혼합한다.
    참고: 제시된 기술은 EYFP에 융합된 C1V1의 캄키아 프로모터 구동 발현을 이용한 AAV 벡터에 대해 시험하였다(AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, 역가: 2.5 x 1012 바이러스 분자/mL; 물질표참조).
  7. 혼합 바이러스를 0.2 mL 고압 IV 튜브에 로드합니다(재료 표참조).
  8. 바이러스 주입 라인을 준비하기 위한 MR 스캐너 외부에 멸균 장을 설치합니다.
  9. 고압 IV 튜브를 사용하여 MR 호환 3 mL 주사기와 식염수프라임에 긴 연장 라인 (MR 보어에 대한 주입 펌프의 위치에 따라 약 3-5 미터)을 연결합니다.
  10. 바이러스가 로드된 0.2 mL IV 튜브의 근측 끝에 긴 연장 선의 말단을 연결하고 역류 방지 캐뉼라를 1 mm 스프팁(그림2D;캐뉼라 생산 지침의 섹션 5 참조)의 말단끝에 부착합니다. 클램프 스타일 카테터 커넥터가 있는 이 어셈블리(재료 표참조) (그림2E).
  11. 마지막으로, MR 호환 펌프에 주사기를 설정합니다(재료 표참조). 펌프 컨트롤러는 MR과 호환되지 않기 때문에 스캐너 제어실에 놓습니다.
  12. 이전에 얻은 기준선 해부학 MR 이미지를 사용하여 대상 주입 부위에 도달하는 데 필요한 캐뉼라 주입 그리드 위치와 삽입 깊이를 선택합니다. 멸균 테이프를 사용하여 캐뉼라에 삽입 깊이를 표시합니다.
  13. 1 μL / min의 속도로 주입을 시작하고 캐뉼라 팁에서 유체의 배출을 관찰하여 주입 라인에서 유체의 흐름을 시각적으로 검증하십시오.
  14. 주입 라인의 흐름을 유지하면서 주입 그리드를 통해 수동으로 주입 그리드를 삽입하면 침투 된 조직이 삽입 중에 캐뉼라를 막히는 것을 방지할 수 있습니다.
  15. 바이러스 벡터 주입의 온라인 모니터링을 위해 빠른 (2 분) 플래시 T1 가중치 이미지 (플립 각도 = 30 °, 반복 시간 / 에코 시간 = 3.05, 매트릭스 크기 = 128 x 128, 슬라이스 두께 = 1mm, 64 슬라이스)를 획득하십시오.
  16. MR 스캐너에서 검출하기에 충분한 바이러스가 주입되도록 벡터의 ~10 μL을 주입한 후, MR 영상을 얻어 바이러스의 관찰된 확산에 의해 명백한 바와 같이 올바른 캐뉼라 배치를 확인한다. 삽입된 캐뉼라의 깊이가 올바르지 않으면 그에 따라 깊이를 조정하거나 캐뉼라를 천천히 제거하고 3.12에서와 같이 삽입을 다시 시도하십시오.
  17. 온라인 MR 이미지의 안내를 통해 주입을 모니터링하고 (플래시 T1 가중) 주입 속도를 증가 5 μL /분 1 μL / 분 단계마다 몇 분 (그림 3A).
  18. 바이러스 벡터의 약 40 μL을 주입 한 후 주입 속도를 1 μL / min 단계로 줄이기 시작하고 ~ 50 μL주입 후 주입을 중지하고 캐뉼라를 10 분 동안 제자리에 둡니다.
  19. 천천히 뇌에서 캐뉼라를 제거하고 다음 위치로 이동합니다. 각 위치에 대해 3.9~3.19단계를 반복합니다.
  20. 동물 수송 전에 주사 끝에 멸균 드레이프로 실린더를 덮습니다. 그런 다음 동물을 수술실로 다시 옮김시고.
  21. MR 호환 챔버를 이식하고 뼈 플랩과 겹쳐진 근육을 교체하고 표준 무균 기술을 사용하여 피부를 봉합하거나 챔버를 티타늄 실린더 및 인공 경루로 교체하여 수술 절개를 닫습니다(참조) 야즈단-샤모라드 외. 20169)신경 녹음 및 자극.

4. MR 호환 챔버 생산

  1. 나일론 캐뉼라 사출 그리드 (그림1A-B)를지정된 치수에 따라 가공하여 제작합니다 (보충그림1).
  2. 아크릴로니트리리리티엔 스티렌(ABS0 플라스틱(그림1C-E)에서MR 호환 실린더를 3D 인쇄합니다(추가 파일 1-3참조, 3D 프린터 및 재료용 재료 표 참조).
    참고: 하나의 설계는 MR 호환 실린더(그림1C)내에서 고정 캐뉼라 사출 그리드를 유지하며, 다른 설계는 그리드의 회전을 허용하고 사출 영역을 확장합니다(그림1D-E).
  3. 캐뉼라 사출 그리드를 스레드하고 두 조각이 동일한 스레딩을 나타내지 있도록 MR 호환 챔버의 해당 캐비티를 탭합니다.
    참고: 두 구성 요소에 동일한 스레딩이 있는 경우 모든 유형의 스레딩을 사용할 수 있습니다.
  4. MR 호환 실린더의 탭된 구멍에 나사로 조여 나일론 캐뉼라 사출 그리드를 삽입합니다.

5. 역류 내성 캐뉼라 생산13

  1. 면도날을 사용하여 내부 실리카 튜브(재료 표참조)에 대해 0.32 mm ID와 0.43 mm OD로 30cm 길이의 실리카 튜브를 자른다.
  2. 7.5 cm 길이와 0.45 mm ID와 0.76 mm OD로 5cm 길이의 실리카 튜브를 자르면 외부 실리카 튜브가 있습니다(재료 표참조).
  3. 7.5 cm 외부 튜브를 시아노아크릴레이트로 30cm 내부 튜브에 부착하여 내부 튜브가 외부 튜브를 넘어 1mm 연장되도록하여 역류 방지 단계를 만듭니다(그림 2D). 시아노아크릴레이트내부튜브의 내부로 들어가지 않도록 하기 위해, 캐뉼라 팁에서 멀리 떨어진 내부 튜브의 바깥쪽에 시아노아크릴레이를 놓습니다.
  4. 클램프 스타일 카테터 커넥터에 부착하기 위해 내부 튜브의 다른 쪽 끝에 5cm 길이의 실리카 튜브를 붙여 넣습니다(단계 3.10 참조).

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결과

MRI 지침에 따라 대류 향상된 전달 (CED)

바이러스 벡터의 확산은 온라인 MR 이미지의 지도하에 CED 주입동안 모니터링되었다(도 3A). 본 연구에서는, 두 마리의 원숭이의 S1및 M1을 표적으로 하였다(도 3B). 3차원 분포량은 Yazdan-Shahmorad 등 에서 설명한 바와 같이 MR 이미지(그림3C)의사후 분석에서 추정되었으며, 2016년 9월 9일, 피질의 넓은 영역의 커버리지를 확인하였다. 원숭이 G에 대한 M1 주입은 시간 제약으로 인해 MR 안내없이 수행되었습니다.

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토론

여기에서, 우리는 MR 유도된 CED에 의하여 NHP 1 차 체감각 및 모터 피질에 있는 대규모 광유전학 표현을 달성하기위한 실행 가능하고 능률적인 기술을 개략적으로 설명합니다. MR 유도 CED의 사용은 NHP 두뇌에 있는 바이러스성 주입의 전통적인 방법에 비해 중요한 이점을 제시합니다. 이러한 장점 중 하나는 필요한 주입이 적은 넓은 영역에 대한 발현을 달성할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 종래의 방법으로, 2-3 mm 직경 영역 1,2,5,17에서벡터 항복 발현의 1-2 μL의 다중 주사. 대규모 벡터 확산을 달성하기위한 이전의 시도는 여러 주사18로약 10mm3의 발현 량을 산출했지만, 여기에서우리는 몇 가지 주입만으로 200 m...

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공개 사항

PNS는 뇌 자극을 이용한 임상 치료를 개발하는 회사인 Neuralink Corp.에 재정적 관심을 가지고 있습니다.

감사의 글

이 작품은 미국 심장 협회 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었다 (AY), 국방 고급 연구 프로젝트 기관 (DARPA) 구조 조정 및 가소성 부상 복구를 가속화하기 위해 (수리; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, UCSF 신경 과학 이미징 센터에 의해. 이 작품은 또한 수상 번호 K12HD073945, 워싱턴 국립 영장류 연구 센터 (WaNPCR, P51 OD010425)에 따라 국립 보건원의 유니스 케네디 시버 국립 연구소및 인간 개발에 의해 지원되었다 신경 기술 센터 (CNT, 그랜트 EEC-1028725에서 국립 과학 재단 공학 연구 센터). 카밀로 디아즈 보티아, 팀 핸슨, 빅토르 카라지아, 다니엘 실버스미스, 카렌 J. 맥클리오드, 줄리아나 밀라니, 블레이클리 앤드류스가 실험과 난 티안, 지웨이 허, 피터 레도쇼이치, 미셸 마하르비즈, 토니 하운의 도움을 받아 준 것에 대해 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 mL 고압 IV 튜빙Smiths Medical Inc., 더블린, 오하이오, 미국533640
0.32 mm ID, 0.43 mm OD 실리카 튜빙Polymicro Technologies1068150027
0.45 mm ID, 0.76 mm OD 실리카 튜빙Polymicro Technologies1068150625
AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFPPenn Vector Core, 펜실베니아
ABS 플라스틱Stratasys, MN, USAABSplus-P430
항균 절개 드레이프3M6650EZ이오반 드레이프
치과 아크릴Henry Schein, Inc.1013117아크릴 결합제
엘리베이터VWR International, LLC.10196-564Langenbeck 엘리베이터, 와이드 팁
미세 봉합사McKesson Medical-Surgical Inc.
GadoteridolProhance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ0270-1111-04
광 자극용 레이저Omicron-Laserage, 독일PhoxX 488-60
MR 호환 3cc 주사기Harvard 장치, Holliston, MA, USA59-8377
MR 이미징 소프트웨어PixmeoOsiriX MD 10.0
MR 호환 펌프하버드 장치, 홀리스턴, 매사추세츠, 미국Harvard PHD 2000
MR 호환 입위 프레임KOPF1430M MRI
페리픽스 클램프 스타일 카테터 커넥터B-Braun, 베들레헴, 펜실베니아, 미국N/A
플라스틱 나사플라스틱 10-80 x 1/8N나일론 나사
티타늄 나사Crist Instrument Co., Inc.6-YCX-0312셀프 태핑 뼈 나사
TrephineGerMedUSA Inc,SKU:GV70-42
uPrinter SE 3D 프린터Stratasys, MN, USAN/A
Vitamin E CapsulePure Encapsulations, LLC.DE1
습식 멸균 흡수성 젤라틴Pfizer Inc.AZL0009034201젤폼
대학교1034505

참고문헌

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대류 온라인 MRI 이미지의 지도하에 Rhesus Macaque의 피질에 광유전학 아데노 관련 바이러스 벡터의 향상된 납품
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