रसायन चिकित्सा-प्रेरित म्यूकोसाइटिस के माउस मॉडल का उपयोग करके छोटे आंत्र चोट और अनुकूलन का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण एंडपॉइंट और प्रोliferative मार्कर
Summary
यहाँ, हम रसायन चिकित्सा प्रेरित mucositis के एक मॉडल का उपयोग कर छोटे आंतों की चोट और प्रतिपूरक अतिप्रसार के महत्वपूर्ण समापन बिंदु और proliferative मार्करों स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम एक सेल चक्र विशिष्ट मार्कर का उपयोग कर और समापन बिंदु के रूप में छोटे आंतों के वजन, crypt गहराई, और गांव ऊंचाई का उपयोग कर proliferating कोशिकाओं का पता लगाने का प्रदर्शन.
Abstract
आंत्र अनुकूलन प्राकृतिक प्रतिपूरक तंत्र है जो तब होता है जब आंत्र आघात के कारण खो जाती है। अनुकूली प्रतिक्रियाओं, इस तरह के crypt सेल प्रसार और वृद्धि हुई पोषक तत्व अवशोषण के रूप में, वसूली में महत्वपूर्ण हैं, अभी तक खराब समझ. अनुकूली प्रतिक्रियाओं के पीछे आणविक तंत्र को समझना अनुकूलन बढ़ाने के लिए पोषक तत्वों या दवाओं की पहचान को सुविधाजनक बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। विभिन्न दृष्टिकोण और मॉडल साहित्य भर में वर्णित किया गया है, लेकिन अनिवार्य रूप से प्रक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत वर्णनात्मक तरीका reproduible डेटा प्राप्त करने की जरूरत है. यहाँ, हम चूहों में कीमोथेरेपी प्रेरित mucositis के एक मॉडल का उपयोग कर छोटे आंतों की चोट और प्रतिपूरक अतिप्रसार के महत्वपूर्ण समापन बिंदु और proliferative मार्करों का अनुमान लगाने के लिए एक विधि का वर्णन. हम एक सेल चक्र विशिष्ट मार्कर का उपयोग कर proliferating कोशिकाओं का पता लगाने का प्रदर्शन, साथ ही साथ समापन बिंदु के रूप में छोटे आंतों के वजन, crypt गहराई, और villus ऊंचाई का उपयोग कर. वर्णित विधि के भीतर महत्वपूर्ण कदम के कुछ हटाने और छोटी आंत के वजन और बल्कि जटिल सॉफ्टवेयर प्रणाली इस तकनीक की माप के लिए सुझाव दिया है. इन तरीकों लाभ है कि वे समय लेने वाली नहीं हैं, और है कि वे लागत प्रभावी और बाहर ले जाने और उपाय करने के लिए आसान कर रहे हैं.
Introduction
आंत्र अनुकूलन एक प्राकृतिक प्रतिपूरक तंत्र है जो रोग या शल्य चिकित्सा1,2के कारण आंत्र के खो जाने पर होता है . आघात के बाद, आंत एक morphometric और कार्यात्मक अनुकूली प्रतिक्रिया से होकर गुजरती है, जो क्रिप्ट सेल प्रसार और बढ़ी हुई पोषक तत्व अवशोषण3की विशेषता है। यह कदम वसूली में महत्वपूर्ण है, अभी तक खराब समझ. आंतों अनुकूली प्रतिक्रिया के प्रायोगिक अध्ययन चूहों, चूहों, और सूअरों में छोटे आंत्र लकीर के बाद होने वाले परिवर्तनों पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन चोटों के अन्य प्रकार में अनुकूली प्रतिक्रिया के पीछे आणविक तंत्र को समझने (जैसे, रासायनिक या जीवाणु) अनुकूलन बढ़ाने के लिए पोषक तत्वों या दवाओं की पहचान की सुविधा के लिए महत्वपूर्ण है. प्रायोगिक रूप से, विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग छोटे आंतों की पैथोलॉजी के जटिल आणविक और सेलुलर सूचकांक का वर्णन करने के लिए किया गया है, जिसमें हिस्टोपैथोलॉजिकल स्कोरिंग और चोट के परिणाम को मापने शामिल है। इस के बावजूद, क्या साहित्य से अनुपस्थित है कैसे प्रक्रियाओं है कि reproduible डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत विवरण है. जब अनुकूलन में शामिल कारकों की पहचान, इस तरह के आंत हार्मोन के रूप में, एक आसान, कम लागत, और reproduible पशु मॉडल warranted है और यहाँ हम रसायन चिकित्सा प्रेरित आंत्र mucositis (CIM) के एक मॉडल का उपयोग करने का सुझाव.
दोनों चोट और अनुकूलन के सरलतम और बहुत जानकारीपूर्ण समापन बिंदु में से एक छोटी आंत (एसआई) के द्रव्यमान को मापने के लिए है। हम जानते हैं कि म्यूकोसाइटिस की एक पहचान आंत्रकोशिकाओं, समय पर निर्भर ग्राम शोष और कम मिटोसिस का एपोप्टोसिस है। अतः आंत्र आकृति विज्ञान की जांच पूर्व नैदानिक मॉडलों 4,5में अत्यधिक प्रासंगिक है। मनुष्यों में, प्लाज्मा citrulline में गिरावट, कार्य entercytes के एक मार्कर, विषाक्तता स्कोर और भड़काऊ मार्करों के साथ सहसंबंध6 अवशोषण क्षमता के अलावा7, इस एमिनो एसिड का सुझाव एक उत्कृष्ट biomarker है म्यूकोशोटिस। Citrulline दोनों चूहों और चूहों में मापा जा सकताहै, और गांव लंबाई 8, crypt अस्तित्व9,और विकिरण प्रेरित mucositis10के साथ उत्कृष्ट सहसंबंध दिखाया गया है.
प्लाज्मा citrulline को मापने का एक प्रमुख लाभ के लिए एक जानवर से दोहराया माप इकट्ठा करने की क्षमता है. हालांकि, चूहों में कई रक्त नमूने की कुल रक्त की मात्रा के लिए प्रतिबंधित है 6 $L/g/सप्ताह और सामान्य संज्ञाहरण की आवश्यकता है. यह दुर्भाग्य से भी चूहों में citrulline माप के उपयोग को सीमित करता है. इसके अलावा, सिट्रुलाइन की माप के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी11,12,की आवश्यकता होती है जो महंगा और समय लेने वाली है। हाल ही में, हमने दिखाया कि चूहों में citrulline स्तर एसआई वजन के साथ काफी सहसंबंधित (पी एंड एलटी; 0.001) (अप्रकाशित डेटा), citrulline एक प्रत्यक्ष माप entercyte द्रव्यमान को दर्शाती बनाने. एसआई वजन की माप के लिए एक सीमा चूहों के लिए आवश्यकता के लिए बलिदान किया जा रहा है और इस तरह एक ही माउस के भीतर कोई दोहराया माप संभव हो रहे हैं. फिर भी विधि अन्य ऊतक अनुसंधान प्रश्न के लिए निर्देशित विश्लेषण की एक किस्म प्रदर्शन करने की संभावना प्रदान करता है, और इन तथ्यों को conceivably जानवरों के अतिरिक्त उपयोग के लिए कर सकते हैं. इसलिए, हम चूहों में चोट और अनुकूलन के एक आसान, कम लागत, और तेजी से biomarker के रूप में एसआई वजन का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। पुन: उत्पादनीयता और स्वीकार्य विश्लेषणात्मक भिन्नता सुनिश्चित करने के लिए, आंतों को ध्यान से जानवर से हटाया जाना चाहिए, वजन से पहले नमकीन, खाली और सूखे के साथ फ्लश किया जाना चाहिए। इस आलेख में, हम दिखाएँ कि यह कार्यविधि कैसे की जाती है.
श्लेष्मशोद की एक अन्य विशेषता यह है कि प्रयोक्ता काल3के दौरान क्रिप्ट्स में उत्तेजित कोशिकाओं का नुकसान और प्रतिपूरक अतिअप्रसार . सेल्यूलर मार्कर Ki67 का प्रयोग इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री13के माध्यम से तेजी से प्रजननात्मक कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए अक्सर किया जाता रहा है . हालांकि Ki67 प्रसार का एक सरल मार्कर है, यह imprecision के लिए एक प्रवृत्ति है के रूप में Ki67 सेल चक्र के सभी सक्रिय चरणों के दौरान मौजूद है (G1, एस, G2, और एम)14. विशिष्ट लेबलिंग प्रतिकृति कोशिकाओं का पता लगाने के लिए आवश्यक है, यही वजह है कि हम 5-ब्रोमो-2′-deoxyuridine (BrdU), थाइमिडीन का एक सिंथेटिक एनालॉग, के रूप में यह काफी हद तक एस चरण15में कोशिकाओं की नकल करने के लिए प्रतिबंधित है की सीटू शामिल करने में सुझाव है। BdU जानवरों में इंजेक्शन है 150 मिनट त्याग से पहले और कोशिकाओं को बाद में BrdU विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ पता लगाया जा सकता है. इस विधि लेख में, हम वास्तव में कैसे एक मुक्त छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक crypt के भीतर BrdU इम्यूनोपॉजिटिव कोशिकाओं के क्षेत्र को मापने के लिए दिखा.
Morphologic और कार्यात्मक परिवर्तन अक्सर 5-FU प्रेरित mucositis मॉडल में अध्ययन कर रहे हैं, जहां आंतों अनुकूलन villus ऊंचाई और crypt गहराई द्वारा मूल्यांकन किया जाता है. इस अध्ययन के दौरान, हमने पाया कि mucositis के तीव्र चरण के दौरान, जो चोट चरण के बराबर है, BrdU निगमन द्वारा मापा प्रसार crypt गहराई के साथ सहसंबद्ध नहीं है. इस के विपरीत, crypt गहराई काफी mucositis की मरम्मत चरण में देखा प्रसार के साथ सहसंबद्ध है, 3 से 5 दिनों के प्रेरण के बाद. यह पता चलता है कि mucositis के तीव्र चरण अकेले crypt गहराई से औसत दर्जे का नहीं है. हमारा सुझाव है कि mucositis चूहों के तीव्र चरण में एक समापन बिंदु के रूप में प्रसार का उपयोग करते समय, BrdU निगमन अधिमानतः इस्तेमाल किया जाना चाहिए, लेकिन जब पुनर्योजी चरण के दौरान बाद के चरण में अतिप्रसार परिमाणित, crypt गहराई एक उचित है BrdU निगमन के लिए विकल्प. इस अध्ययन का लक्ष्य इस मॉडल का इस तरीके से वर्णन करना था कि इसका उपयोग सभी शोधकर्ताओं द्वारा ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र में किया जा सकता है, लेकिन विशेष रूप से शोधकर्ताओं को आंतों की चोट के मॉडल से परिचित नहीं है।
वर्णित मॉडल शरीर के वजन का उपयोग कर अनुकूली प्रतिक्रिया के अनुसार ट्रांसजेनिक मॉडल phenotype करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एसआई वजन और अंतिमबिंदु के रूप में crypt गहराई. एक उदाहरण के रूप में, हम यहाँ दिखाने के लिए कैसे हम एक सेलुलर दस्तक मॉडल में 5-fluorouracil (5-FU) प्रेरित mucositis के मॉडल का इस्तेमाल किया अपर्याप्त एल सेल स्राव16के साथ बाहर मॉडल दस्तक . ग्लूकागन की तरह पेप्टाइड-1 (जीएलपी-1) और ग्लूकागन जैसे पेप्टाइड-2 (जीएलपी-2) आंतों के हार्मोन हैं जो भोजन सेवन के जवाब में आंत्र अंत: स्रावी एल-कोशिकाओं से सह-स्रावित होते हैं17,18। जीएलपी-2 को आंतों के उपचार के लिए एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में मान्यता प्राप्त है , म्यूकोसल एपोप्टोसिस का विनियमन और एसआई19,20,21,22के अवरोध समारोह में सुधार . साहित्य के आधार पर, हम hypothesized है कि अंतर्जात हार्मोन चोट के बाद अनुकूली प्रतिक्रिया में होने वाली प्रतिपूरक अतिप्रसार के लिए आवश्यक हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम एक माउस मॉडल में एसआई चोट और पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से सुलभ विधि का प्रदर्शन. आंतों की चोट के पूर्व नैदानिक पशु मॉडल की एक विस्तृत विविधता मौजूद है, लेकिन यह महत्वपूर्ण है क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम बुनियादी मेटाबोलिक अनुसंधान और Lundbeck फाउंडेशन के लिए नोवो Nordisk केंद्र से एक अप्रतिबंधित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
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