Vigtige endepunkter og proliferative markører til at vurdere små tarmskader og tilpasning ved hjælp af en muse model af kemoterapi-induceret mucositis

Summary

Her præsenterer vi en protokol for at etablere vigtige endepunkter og proliferativ markører for små tarmskader og kompenserende hyperproliferation ved hjælp af en model af kemoterapi-induceret mucositis. Vi demonstrerer påvisning af prolifererende celler ved hjælp af en celle cyklus specifik markør og ved hjælp af lille tarm vægt, krypt dybde, og villus højde som endepunkter.

Abstract

Intestinal tilpasning er den naturlige kompenserende mekanisme, der opstår, når tarmen er tabt på grund af traumer. De adaptive reaktioner, såsom Crypt celle proliferation og øget næringsstof absorption, er afgørende i opsving, men dårligt forstået. Forståelse af den molekylære mekanisme bag de adaptive reaktioner er afgørende for at lette identifikationen af næringsstoffer eller lægemidler til at forbedre tilpasningen. Forskellige tilgange og modeller er blevet beskrevet i hele litteraturen, men en detaljeret beskrivende måde at hovedsagelig udføre procedurerne er nødvendig for at opnå reproducerbare data. Her beskriver vi en metode til at anslå vigtige endepunkter og proliferativ markører for små tarmskader og kompenserende hyperproliferation ved hjælp af en model af kemoterapi-induceret mucositis i mus. Vi demonstrerer påvisning af prolifererende celler ved hjælp af en celle cyklus specifik markør, samt ved hjælp af lille tarm vægt, krypt dybde, og villus højde som endepunkter. Nogle af de kritiske trin inden for den beskrevne metode er fjernelse og vejning af tyndtarmen og det temmelig komplekse software system, der foreslås til måling af denne teknik. Disse metoder har de fordele, at de ikke er tidskrævende, og at de er omkostningseffektive og lette at gennemføre og måle.

Introduction

Intestinal tilpasning er den naturlige kompenserende mekanisme, der opstår, når tarmen er tabt på grund af sygdom eller kirurgi^1,2. Efter traume gennemgår tarmen en morphometrisk og funktionel adaptiv respons, karakteriseret ved krypt celle spredning og øget næringsstof absorption³. Dette trin er kritisk i Recovery, men dårligt forstået. Eksperimentelle undersøgelser af intestinal adaptiv respons har fokuseret på de ændringer, der opstår efter lille tarm resektion i mus, rotter og grise, men forstå den molekylære mekanisme bag den adaptive respons i andre former for skader (f. eks. kemisk eller bakteriel) er afgørende for at lette identifikationen af næringsstoffer eller stoffer for at forbedre tilpasningen. Eksperimentelt, forskellige tilgange er blevet brugt til at beskrive det komplekse molekylære og cellulære indeks af små tarm patologi, herunder histopatologiske scoring og måling af resultatet af skaden. På trods af dette, hvad der er fraværende fra litteraturen er en detaljeret beskrivelse af, hvordan man udfører de procedurer, der er nødvendige for at opnå reproducerbare data. Når man identificerer faktorer involveret i tilpasning, såsom Gut hormoner, en nem, lav pris, og reproducerbare dyremodel er berettiget, og her foreslår vi at bruge en model af kemoterapi-induceret intestinal mucositis (CIM).

En af de enkleste og meget informative endepunkter for både skade og tilpasning er at måle massen af tyndtarmen (SI). Vi ved, at et kendetegn for mucositis er apoptose af enterocytter, tidsafhængig villus atrofi og reduceret mitose. Derfor er undersøgelse af intestinal morfologi yderst relevant i prækliniske modeller^4,5. Hos mennesker, et fald i plasma citrullin, en markør for fungerende enterocytter, korrelerer med toksicitet scores og inflammatoriske markører⁶ ud over absorptionsevne⁷, tyder denne aminosyre er en fremragende biomarkør af Mucositis. Citrullin kan måles i både mus og rotter, og har vist fremragende korrelationer med villus længde⁸, Crypt overlevelse⁹, og stråling-induceret mucositis¹⁰.

En stor fordel ved at måle plasma citrullin er evnen til at indsamle gentagne målinger fra et dyr. Flere blodprøver i mus er dog begrænset til et samlet blodvolumen på 6 μL/g/uge og kræver generel anæstesi. Dette begrænser desværre også brugen af citrullin målinger i mus. Desuden kræver målingen af citrullin højtydende væskekromatografi^11,12, hvilket er dyrt og tidskrævende. For nylig viste vi, at citrullin niveauer i mus korrelerer betydeligt med si vægt (p < 0,001) (ikke-offentliggjorte data), hvilket gør citrullin en direkte måling afspejler i masse. En begrænsning til måling af SI-vægt er nødvendigheden af, at musene ofres, og derfor er det ikke muligt at gentage målinger inden for samme mus. Stadig metoden giver mulighed for at udføre en række andre vævs analyser rettet mod forskningen spørgsmål, og disse kendsgerninger kan tænkes at gøre op for den ekstra brug af dyr. Vi foreslår derfor at bruge SI vægt som en nem, billig og hurtig biomarkør af skade og tilpasning i mus. For at sikre reproducerbarhed og acceptabel analytisk variation bør tarmene fjernes forsigtigt fra dyret, skylles med saltvand, tømmes og tørres inden vejning. I denne artikel viser vi nøjagtigt, hvordan denne procedure udføres.

Et andet kendetegn for mucositis er tabet af de prolifererende celler i krypterne og en kompenserende hyperproliferation i den regenerativ periode³. Den cellulære markør Ki67 er ofte blevet brugt til at bestemme hurtige proliferativ celler ved hjælp af immun histokemi¹³. Selvom Ki67 er en simpel markør for spredning, har den en tendens til upræcision, da Ki67 er til stede i alle aktive faser af cellecyklussen (G1, S, G2 og M)¹⁴. Specifik mærkning er afgørende for at detektere repliklerende celler, og derfor foreslår vi in situ inkorporering af 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU), en syntetisk analog af thymidin, da den i vid udstrækning er begrænset til replicerende celler i S-fase¹⁵. BrdU injiceres i dyrene 150 minutter før ofring og celler kan efterfølgende påvises med immun histokemi ved hjælp af BrdU specifikke antistoffer. I denne metode artikel, viser vi præcis, hvordan man måler området af BrdU immunopositive celler i en krypt ved hjælp af en gratis billedsoftware.

Morfologiske og funktionelle ændringer er ofte undersøgt i 5-FU induceret mucositis modeller, hvor intestinal tilpasning er vurderet af villus højde og krypt dybde. I løbet af denne undersøgelse, vi fandt, at under den akutte fase af mucositis, som er lig med skades fasen, spredning målt ved BrdU inkorporering er ikke korreleret med Crypt dybde. I modsætning til dette, Crypt dybde er signifikant korreleret med spredning ses i reparations fasen af mucositis, 3 til 5 dage efter induktion. Dette tyder på, at den akutte fase af mucositis ikke er målbar ved krypt dybde alene. Vi foreslår, at når du bruger proliferation som endepunkt i den akutte fase af mucositis-mus, bør brdu inkorporering fortrinsvis anvendes, men når du kvantiterer hyperproliferation i det senere stadie i den regenerativ fase, er Crypt-dybden en fornuftig alternativ til BrdU inkorporering. Målet med denne undersøgelse var at beskrive denne model på en måde, at den kan bruges af alle forskere, både inden for onkologi, men især forskere, der ikke er bekendt med tarm skade modeller.

Den beskrevne model kan bruges til fænotype transgene modeller i henhold til den adaptive respons ved hjælp af kropsvægt, si vægt og krypt dybde som endepunkter. Som et eksempel viser vi her, hvordan vi brugte modellen af 5-fluorouracil (5-FU) induceret mucositis i en cellulær knock out model med utilstrækkelig L-celle sekretion¹⁶. Glucagon-lignende peptid-1 (GLP-1) og Glucagon-lignende peptid-2 (GLP-2) er intestinale hormoner, der udskilles fra de enteroendokrine L-celler som reaktion på fødeindtagelse^17,18. GLP-2 er anerkendt som en vigtig faktor for tarm heling, reguleringen af slimhinde apoptose og forbedring af barrierefunktionen af si^19,20,21,22. Baseret på litteraturen, vi hypotese, at endogene hormoner er afgørende for kompenserende hyperproliferation forekommer i adaptive respons efter skade.

Protocol

Alle beskrevne metoder blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i dansk lovgivning om dyreforsøg (1987). Undersøgelserne blev udført med tilladelse fra det danske dyreforsøg inspektorat (2013-15-2934-00833) og det lokale etiske udvalg. Bemærk: kvindelige C57BL/6J mus (~ 20 − 25 g) blev opnået og husede otte pr. bur i standard 12 h lys, 12 h mørk cyklus med fri adgang til vand og standard Chow. Dyr blev overladt til akklimatiserer i en uge før eksperimenter begyndte. <…

Representative Results

I det første eksperiment inducerede vi mucositis hos mus på dag 0 og ofrede en gruppe mus hver dag i 5 på hinanden følgende dage. Ved måling af si vægt, vi fandt, at denne parameter faldt fra dag 2 indtil dag 4 tyder på et tab i i masse. Vi konstaterede også, at på dag 5 var SI-vægten ikke signifikant forskellig fra dag 0 (ubehandlede mus) (figur 1). Spredningen målt ved inkorporering af BrdU blev næsten afskaffet på dag 1 og dag 2, men på dag 4…

Discussion

Her viser vi en bredt tilgængelig metode til at studere SI skade og regenerering i en musemodel. En bred vifte af prækliniske dyremodeller af tarm skade findes, men det er afgørende, at vi forstår, at hver model er unik, og at endepunkterne skal være passende at besvare forskningen spørgsmål. Denne model er fremragende til at studere adaptive respons på skade, men endepunkterne bør ændres, når du bruger modellen som en præklinisk model af mucositis. Men, oversættelse fra dyremodeller til patienter er udfordr…

Materials

5-Fluorouracil	Hospira Nordic AB, Sweden	137853
Ketaminol®Vet	Merck, New Jersey, USA	511485
Rompun®Vet Xylazine	Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany.	148999
10% nautral formalin buffer	Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom	BAF-5000-08A
HistoClear	National Diagnostics, United Kingdom	HS-200
Pertex	HistoLab®, Sweden	840
BrdU	Sigma-Aldrich, Germany.	B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer	Thermofisher scientific, Denmark	TA-125-PM4X
Peroxide Block	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
Rodent Block buffer	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody	Thermofisher Scientific, Denmark.	MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto	Thermofisher Scientific, Denmark.	TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate	DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen	DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition)	Carl Zeiss A/S		https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software	LOCI, University of Wisconsin		https://imagej.nih.gov/ij/