Wichtige Endpunkte und proliferative Marker zur Beurteilung von kleinen Darmverletzungen und Anpassung mit einem Mausmodell der Chemotherapie-induzierten Mukositis
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Festlegung wichtiger Endpunkte und proliferativer Marker für kleine Darmverletzungen und kompensatorische Hyperproliferation unter Verwendung eines Modells der chemotherapieinduzierten Schleimhautitis vor. Wir demonstrieren die Detektion von sich vermehrenden Zellen mit einem zellzyklusspezifischen Marker und mit kleinem Darmgewicht, Kryptatiefe und Villushöhe als Endpunkte.
Abstract
Darmanpassung ist der natürliche Kompensationsmechanismus, der auftritt, wenn der Darm durch ein Trauma verloren geht. Die adaptiven Reaktionen, wie die Proliferation von Kryptazellen und die erhöhte Nährstoffaufnahme, sind entscheidend für die Erholung, aber schlecht verstanden. Das Verständnis des molekularen Mechanismus hinter den adaptiven Reaktionen ist von entscheidender Bedeutung, um die Identifizierung von Nährstoffen oder Medikamenten zu erleichtern, um die Anpassung zu verbessern. Verschiedene Ansätze und Modelle wurden in der gesamten Literatur beschrieben, aber eine detaillierte beschreibende Möglichkeit, die Verfahren im Wesentlichen durchzuführen, ist erforderlich, um reproduzierbare Daten zu erhalten. Hier beschreiben wir eine Methode zur Schätzung wichtiger Endpunkte und proliferativer Marker kleiner Darmverletzungen und kompensatorischer Hyperproliferation mit einem Modell der Chemotherapie-induzierten Schleimhautise bei Mäusen. Wir demonstrieren die Detektion von sich vermehrenden Zellen mit einem zellzyklusspezifischen Marker sowie mit kleinem Darmgewicht, Kryptatiefe und Villushöhe als Endpunkt. Einige der kritischen Schritte innerhalb der beschriebenen Methode sind die Entfernung und Das Wiegen des Dünndarms und das recht komplexe Softwaresystem, das für die Messung dieser Technik vorgeschlagen wird. Diese Methoden haben die Vorteile, dass sie nicht zeitaufwändig sind, und dass sie kostengünstig und einfach durchzuführen und zu messen sind.
Introduction
Darmanpassung ist der natürliche Kompensationsmechanismus, der auftritt, wenn der Darm aufgrund von Krankheit oder Operation verloren geht1,2. Nach einem Trauma erfährt der Darm eine morphometrische und funktionelle adaptive Reaktion, die durch Dieproliferation von Kryptazellen und erhöhte Nährstoffaufnahme gekennzeichnet ist3. Dieser Schritt ist entscheidend für die Wiederherstellung, aber schlecht verstanden. Experimentelle Studien der darmadaptiven Reaktion konzentrierten sich auf die Veränderungen, die nach der kleinen Darmresektion bei Mäusen, Ratten und Schweinen auftreten, aber das Verständnis des molekularen Mechanismus hinter der adaptiven Reaktion bei anderen Arten von Verletzungen (z. B. chemische oder bakterielle) ist entscheidend, um die Identifizierung von Nährstoffen oder Medikamenten zu erleichtern, um die Anpassung zu verbessern. Experimentell wurden verschiedene Ansätze verwendet, um den komplexen molekularen und zellulären Index der kleinen Darmpathologie zu beschreiben, einschließlich histopathologischer Bewertung und Messung des Verletzungsergebnisses. Dennoch fehlt in der Literatur eine detaillierte Beschreibung der Verfahren, die erforderlich sind, um reproduzierbare Daten zu erhalten. Bei der Identifizierung von Anpassungsfaktoren wie Darmhormonen ist ein einfaches, kostengünstiges und reproduzierbares Tiermodell gerechtfertigt und hier schlagen wir vor, ein Modell der chemotherapieinduzierten Darmschleimhaut (CIM) zu verwenden.
Einer der einfachsten und sehr informativen Endpunkte sowohl der Verletzung als auch der Anpassung ist die Messung der Masse des Dünndarms (SI). Wir wissen, dass ein Kennzeichen der Schleimisis apoptose von Enterozyten, zeitabhängiger Villusatrophie und reduzierter Mitose ist. Daher ist die Untersuchung der Darmmorphologie in den präklinischen Modellen4,5von hoher Relevanz. Beim Menschen korreliert ein Rückgang des Plasmacitrullins, einem Marker funktionierender Enterozyten, mit Toxizitätswerten und Entzündungsmarkern6 zusätzlich zur Absorptionsfähigkeit7, was darauf hindeutet, dass diese Aminosäure ein ausgezeichneter Biomarker Mukositis. Citrullin kann sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten gemessen werden und hat ausgezeichnete Korrelationen mit Villuslänge8, Krypta Überleben9und strahlungsinduzierte Schleimhaut10 gezeigt.
Ein großer Vorteil der Messung von Plasmacitrullin ist die Fähigkeit, wiederholte Messungen von einem Tier zu sammeln. Mehrere Blutentnahmen bei Mäusen sind jedoch auf ein Gesamtblutvolumen von 6 l/g/Woche beschränkt und erfordern eine Vollnarkose. Dies schränkt leider auch den Einsatz von Citrullinmessungen bei Mäusen ein. Darüber hinaus erfordert die Messung von Citrullin eine hochleistungsstarke Flüssigkeitschromatographie11,12, was teuer und zeitaufwändig ist. Kürzlich haben wir gezeigt, dass Citrullinspiegel bei Mäusen signifikant mit dem SI-Gewicht korrelieren (p < 0,001) (unveröffentlichte Daten), was Citrullin zu einer direkten Messung macht, die die Enterozytenmasse widerspiegelt. Eine Einschränkung der Messung des SI-Gewichts ist die Notwendigkeit, dass die Mäuse geopfert werden müssen und somit keine wiederholten Messungen innerhalb derselben Maus möglich sind. Dennoch bietet die Methode die Möglichkeit, eine Vielzahl anderer Gewebeanalysen durchzuführen, die auf die Forschungsfrage gerichtet sind, und diese Fakten können den zusätzlichen Einsatz von Tieren möglicherweise wettmachen. Wir empfehlen daher, das SI-Gewicht als einfachen, kostengünstigen und schnellen Biomarker für Verletzungen und Anpassung bei Mäusen zu verwenden. Um Reproduzierbarkeit und akzeptable analytische Variation zu gewährleisten, sollte der Darm sorgfältig vom Tier entfernt, mit Herzsäure gespült, geleert und getrocknet werden, bevor es wiegen kann. In diesem Artikel zeigen wir genau, wie dieses Verfahren ausgeführt wird.
Ein weiteres Kennzeichen der Schleimisitis ist der Verlust der sich ausbreitenden Zellen in den Krypten und eine kompensatorische Hyperproliferation während der regenerativen Periode3. Der Zellmarker Ki67 wurde häufig verwendet, um schnelle proliferative Zellen mittels Immunhistochemie zu bestimmen13. Obwohl Ki67 ein einfacher Marker der Proliferation ist, hat es eine Tendenz zur Ungenauigkeit, da Ki67 in allen aktiven Phasen des Zellzyklus vorhanden ist (G1, S, G2 und M)14. Eine spezifische Kennzeichnung ist für den Nachweis replizierender Zellen unerlässlich, weshalb wir in situ die Aufnahme von 5-Brom-2′-Deoxyuridin (BrdU), einem synthetischen Analogon von Thymidin, vorschlagen, da es sich weitgehend auf die Replikation von Zellen in der S-Phase15beschränkt. BrdU wird den Tieren 150 Minuten vor dem Opfern injiziert und Zellen können anschließend mit Immunhistochemie mit BrdU-spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. In diesem Methodenartikel zeigen wir, wie sie die Fläche von BrdU-Immunpositiven Zellen innerhalb einer Krypta mit einer kostenlosen Bildsoftware genau messen können.
Morphologische und funktionelle Veränderungen werden oft in 5-FU-induzierten Schleimhautmodellen untersucht, bei denen die Darmanpassung anhand der Villushöhe und der Kryptatiefe beurteilt wird. Während dieser Studie fanden wir heraus, dass während der akuten Phase der Schleimhautitis, die der Verletzungsphase entspricht, die durch BrdU-Inkorporation gemessene Proliferation nicht mit der Kryptatiefe korreliert. Im Gegensatz dazu ist die Kryptatiefe signifikant mit der Proliferation korreliert, die in der Reparaturphase der Schleimhaut, 3 bis 5 Tage nach der Induktion, beobachtet wird. Dies deutet darauf hin, dass die akute Phase der Schleimhautnichtbezis nicht allein durch die Kryptatiefe messbar ist. Wir schlagen vor, dass bei der Verwendung der Proliferation als Endpunkt in der akuten Phase der Schleimhautmäuse, BrdU-Inkorporation sollte vorzugsweise verwendet werden, aber bei der Quantifizierung Hyperproliferation in der späteren Phase während der regenerativen Phase, Krypta Tiefe ist eine vernünftige Alternative zur BrdU-Eingemeindung. Das Ziel dieser Studie war es, dieses Modell so zu beschreiben, dass es von allen Forschern sowohl auf dem Gebiet der Onkologie, aber vor allem Forschern, die nicht mit Darmverletzungsmodellen vertraut sind, verwendet werden kann.
Das beschriebene Modell kann verwendet werden, um transgene Modelle entsprechend der adaptiven Reaktion unter Verwendung von Körpergewicht, SI-Gewicht und Kryptivtiefe als Endpunkte zu phänotypieren. Als Beispiel zeigen wir hier, wie wir das Modell der 5-Fluorouracil (5-FU) induzierten Schleimhautinitis in einem zellulären Knock-out-Modell mit unzureichender L-Zell-Sekretion16verwendet haben. Glucagon-ähnliche Peptid-1 (GLP-1) und Glucagon-ähnliche Peptid-2 (GLP-2) sind Darmhormone, die von den enteroendokrinel L-Zellen als Reaktion auf die Nahrungsaufnahme17,18mitsezernt werden. GLP-2 ist anerkannt als ein wichtiger Faktor für die Darmheilung, die Regulierung der Schleimhautapoptose und die Verbesserung der Barrierefunktion des SI19,20,21,22. Basierend auf der Literatur vermuteten wir, dass endogene Hormone für die kompensatorische Hyperproliferation, die in der adaptiven Reaktion nach Verletzungen auftritt, unerlässlich sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir eine allgemein zugängliche Methode zur Untersuchung von SI-Verletzungen und Regeneration in einem Mausmodell. Es gibt eine Vielzahl präklinischer Tiermodelle für Darmverletzungen, aber es ist wichtig, dass wir verstehen, dass jedes Modell einzigartig ist und dass die Endpunkte geeignet sein müssen, um die Forschungsfrage zu beantworten. Dieses Modell eignet sich hervorragend, um das adaptive Ansprechen auf Verletzungen zu untersuchen, aber die Endpunkte sollten geändert werden, wenn das Modell als pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein uneingeschränktes Stipendium des Novo Nordisk Center for Basic Metabolic Research und der Lundbeck Foundation unterstützt.
Materials
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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