Puntos finales importantes y marcadores proliferativos para evaluar lesiones intestinales pequeñas y adaptación utilizando un modelo de ratón de mucositis inducida por quimioterapia
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para establecer puntos finales importantes y marcadores proliferativos de pequeña lesión intestinal e hiperproliferación compensatoria utilizando un modelo de mucositis inducida por quimioterapia. Demostramos la detección de células que proliferan utilizando un marcador específico de ciclo celular y utilizando el peso intestinal pequeño, la profundidad de la cripta y la altura de las vellosidades como puntos finales.
Abstract
La adaptación intestinal es el mecanismo compensatorio natural que se produce cuando el intestino se pierde debido a un trauma. Las respuestas adaptativas, como la proliferación de células de cripta y el aumento de la absorción de nutrientes, son fundamentales en la recuperación, pero mal entendidas. Comprender el mecanismo molecular detrás de las respuestas adaptativas es crucial para facilitar la identificación de nutrientes o fármacos para mejorar la adaptación. A lo largo de la literatura se han descrito diferentes enfoques y modelos, pero se necesita una forma descriptiva detallada de realizar esencialmente los procedimientos para obtener datos reproducibles. Aquí, describimos un método para estimar puntos finales importantes y marcadores proliferativos de pequeñalesión intestinal e hiperproliferación compensatoria utilizando un modelo de mucositis inducida por quimioterapia en ratones. Demostramos la detección de células que proliferan utilizando un marcador específico de ciclo celular, así como el uso de peso intestinal pequeño, profundidad de la cripta y altura de vellosidad como puntos finales. Algunos de los pasos críticos dentro del método descrito son la extracción y el pesaje del intestino delgado y el sistema de software bastante complejo sugerido para la medición de esta técnica. Estos métodos tienen las ventajas de que no consumen mucho tiempo y que son rentables y fáciles de llevar a cabo y medir.
Introduction
La adaptación intestinal es el mecanismo compensatorio natural quese produce cuando el intestino se pierde debido a una enfermedad o cirugía 1,2. Después del trauma, el intestino se somete a una respuesta adaptativamorfométrica y funcional, caracterizada por la proliferación celular de la cripta y el aumento de la absorción de nutrientes 3. Este paso es fundamental en la recuperación, pero mal entendido. Los estudios experimentales de la respuesta adaptativa intestinal se han centrado en los cambios que se producen después de la resección del intestino delgado en ratones, ratas y cerdos, pero la comprensión del mecanismo molecular detrás de la respuesta adaptativa en otros tipos de lesiones (por ejemplo, química o bacteriano) es crucial para facilitar la identificación de nutrientes o medicamentos para mejorar la adaptación. Experimentalmente, se han utilizado diferentes enfoques para describir el complejo índice molecular y celular de la pequeña patología intestinal, incluyendo la puntuación histopatológica y la medición del resultado de la lesión. A pesar de esto, lo que está ausente de la literatura es una descripción detallada de cómo realizar los procedimientos que se necesitan para obtener datos reproducibles. Al identificar los factores involucrados en la adaptación, como las hormonas intestinales, se justifica un modelo animal fácil, de bajo costo y reproducible, y aquí sugerimos usar un modelo de mucositis intestinal inducida por quimioterapia (CIM).
Uno de los puntos finales más simples y muy informativos tanto de lesión como de adaptación es medir la masa del intestino delgado (SI). Sabemos que un sello distintivo de la mucositis es la apoptosis de los enterocitos, la atrofia de vellosidades dependiente del tiempo y la reducción de la mitosis. Por lo tanto, el examen de lamorfología intestinal es muy relevante en los modelos preclínicos 4,5. En los seres humanos, una disminución de la citrulina plasmática, un marcador de enterocitos en funcionamiento, se correlaciona con las puntuaciones de toxicidad y los marcadores inflamatorios6 además de la capacidad de absorción7, lo que sugiere que este aminoácido es un excelente biomarcador de Mucositis. La citrulina se puede medir tanto en ratones comoen ratas, y ha demostrado excelentes correlaciones con la longitud de vellosidades 8, la supervivencia de la cripta9y la mucositis inducida por radiación10.
Una de las principales ventajas de medir la citrulina plasmática es la capacidad de recoger mediciones repetidas de un animal. Sin embargo, el muestreo de sangre múltiple en ratones está restringido a un volumen total de sangre de 6 l/g/semana y requiere anestesia general. Esto por desgracia también limita el uso de mediciones de citrulina en ratones. Además, la medición de la citrulina requiere cromatografía líquida de alto rendimiento11,12, que es costosa y requiere mucho tiempo. Recientemente, mostramos que los niveles de citrulina en ratones se correlacionan significativamente con el peso de SI (p < 0.001) (datos no publicados), haciendo de la citrulina una medida directa que refleja la masa de enterocitos. Una limitación a la medición del peso SI es la necesidad de sacrificar los ratones y, por lo tanto, no es posible realizar mediciones repetidas dentro del mismo ratón. Aun así, el método ofrece la posibilidad de realizar una variedad de otros análisis de tejidodirigidos a la pregunta de investigación, y estos hechos pueden compensar el uso adicional de animales. Por lo tanto, sugerimos el uso del peso SI como un biomarcador fácil, de bajo costo y rápido de lesiones y adaptación en ratones. Para garantizar la reproducibilidad y la variación analítica aceptable, los intestinos deben ser cuidadosamente retirados del animal, lavados con salina, vaciados y secados antes de pesar. En este artículo, mostramos exactamente cómo se realiza este procedimiento.
Otro sello distintivo de la mucositis es la pérdida de las células proliferantesen las criptas y una hiperproliferación compensatoria durante el período regenerativo 3. El marcador celular Ki67 se ha utilizado con frecuencia para determinar células proliferativas rápidas por medio de inmunohistoquímica13. A pesar de que Ki67 es un simple marcador de proliferación, tiene una tendencia a la imprecisión ya que Ki67 está presente durante todas las fases activas del ciclo celular (G1, S, G2 y M)14. El etiquetado específico es esencial para detectar células replicantes, por lo que sugerimos la incorporación in situ de 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU), un análogo sintético de la timidina, ya que se limita en gran medida a la replicación de células en la fase S15. BrdU se inyecta en los animales 150 minutos antes del sacrificio y las células se pueden detectar posteriormente con inmunohistoquímica utilizando anticuerpos específicos de BrdU. En este artículo de método, mostramos exactamente cómo medir el área de las células inmunopositivas De dUu dentro de una cripta utilizando un software de imagen libre.
Los cambios morfológicos y funcionales a menudo se estudian en modelos de mucositis inducida por 5-FU, donde la adaptación intestinal se evalúa por altura de vellosidad y profundidad de la cripta. Durante este estudio, encontramos que durante la fase aguda de la mucositis, que es igual a la fase de lesión, la proliferación medida por la incorporación de BrdU no está correlacionada con la profundidad de la cripta. En contraste con esto, la profundidad de la cripta se correlaciona significativamente con la proliferación vista en la fase de reparación de la mucositis, 3 a 5 días después de la inducción. Esto sugiere que la fase aguda de la mucositis no se puede medir solo por la profundidad de la cripta. Sugerimos que cuando se utiliza la proliferación como punto final en la fase aguda de los ratones de mucositis, la incorporación de BrdU debe utilizarse preferentemente, pero al cuantificar la hiperproliferación en la etapa posterior durante la fase regenerativa, la profundidad de la cripta es una profundidad razonable alternativa a la incorporación de BrdU. El objetivo de este estudio fue describir este modelo de una manera que pueda ser utilizado por todos los investigadores, tanto en el campo de la oncología, pero especialmente los investigadores no familiarizados con los modelos de lesión intestinal.
El modelo descrito se puede utilizar para fenotipo modelos transgénicos de acuerdo con la respuesta adaptativa utilizando el peso corporal, el peso SI y la profundidad de la cripta como puntos finales. Como ejemplo, mostramos aquí cómo usamos el modelo de mucositis inducida por 5-fluorouracilo (5-FU) en un modelo celular knock out con secreción insuficiente de células L16. El péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) y el péptido similar al glucagón-2 (GLP-2) son hormonas intestinales cosecretadas de las células L enteroendocrinas en respuesta a la ingesta de alimentos17,18. GLP-2 es reconocido como un factor importante para la curación intestinal, la regulación de la apoptosis mucosa y la mejora de la función barrera del SI19,20,21,22. Basándonos en la literatura, hipotetizómos que las hormonas endógenas son esenciales para la hiperproliferación compensatoria que ocurre en la respuesta adaptativa después de una lesión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, demostramos un método ampliamente accesible para estudiar la lesión SI y la regeneración en un modelo de ratón. Existe una amplia variedad de modelos animales preclínicos de lesión intestinal, pero es vital que entendamos que cada modelo es único y que los puntos finales deben ser apropiados para responder a la pregunta de investigación. Este modelo es excelente para estudiar la respuesta adaptativa a la lesión, pero los puntos finales deben modificarse cuando se utiliza el modelo como un modelo preclíni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención sin restricciones del Novo Nordisk Center for Basic Metabolic Research y la Fundación Lundbeck.
Materials
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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