Viktiga endpoints och proliferativa markörer för att bedöma liten tarm skada och anpassning med hjälp av en musmodell av kemoterapi-inducerad mukosit

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att fastställa viktiga endpoints och proliferativa markörer för liten tarm skada och kompenserande hyperproliferation med hjälp av en modell av kemoterapi-inducerad mukosit. Vi visar upptäckten av prolifererande celler med hjälp av en cell cykel specifik markör och använda liten intestinal vikt, Crypt djup, och moderkaksprov höjd som endpoints.

Abstract

Intestinal anpassning är den naturliga kompenserande mekanism som uppstår när tarmen går förlorad på grund av trauma. Den adaptiva svar, såsom crypt cell proliferation och ökad näringsämne absorption, är avgörande för återhämtning, men dåligt förstått. Att förstå den molekylära mekanismen bakom de adaptiva svaren är avgörande för att underlätta identifieringen av näringsämnen eller läkemedel för att förbättra anpassningen. Olika tillvägagångssätt och modeller har beskrivits i hela litteraturen, men ett detaljerat beskrivande sätt att i huvudsak utföra de förfaranden som behövs för att få reproducerbara data. Här beskriver vi en metod för att uppskatta viktiga endpoints och proliferativa markörer för liten tarm skada och kompensatorisk hyperproliferation med hjälp av en modell av kemoterapiinducerad mukosit hos möss. Vi visar upptäckten av prolifererande celler med hjälp av en cell cykel specifik markör, samt att använda liten intestinal vikt, Crypt djup, och moderkaksprov höjd som endpoints. Några av de kritiska stegen inom den beskrivna metoden är avlägsnande och vägning av tunntarmen och den ganska komplexa mjukvarusystem föreslås för mätning av denna teknik. Dessa metoder har de fördelar som de inte är tidskrävande, och att de är kostnadseffektiva och lätta att utföra och mäta.

Introduction

Intestinal anpassning är den naturliga kompenserande mekanism som uppstår när tarmen går förlorad på grund av sjukdom eller kirurgi^1,2. Efter trauma genomgår tarmen en morphometrisk och funktionell adaptiv respons, som kännetecknas av crypt cell proliferation och ökad näringsämne absorption³. Detta steg är avgörande för återhämtning, men ändå dåligt förstådd. Experimentella studier av intestinal adaptiv respons har fokuserat på de förändringar som sker efter tunntarm resektion hos möss, råttor och svin, men att förstå den molekylära mekanismen bakom det adaptiva svaret i andra typer av skador (t. ex. kemisk eller bakteriell) är avgörande för att underlätta identifieringen av näringsämnen eller läkemedel för att förbättra anpassningen. Experimentellt, olika metoder har använts för att beskriva det komplexa molekylära och cellulära indexet för små tarm patologi, inklusive histopatologisk scoring och mäta resultatet av skadan. Trots detta är vad som saknas i litteraturen en detaljerad beskrivning av hur man utför de procedurer som behövs för att få reproducerbara data. När identifiera faktorer som är involverade i anpassningen, såsom Gut hormoner, en enkel, låg kostnad, och reproducerbara djurmodell är motiverad och här föreslår vi att du använder en modell av kemoterapi-inducerad intestinal mukosit (CIM).

En av de enklaste och mycket informativa endpoints av både skada och anpassning är att mäta massan av tunntarmen (SI). Vi vet att ett kännetecken för mukosit är apoptos av enterocyter, tidsberoende moderkaksprov atrofi och minskad Mitos. Därför är det mycket relevant att undersöka tarmmorfologin i prekliniska modeller^4,5. Hos människa, en nedgång i plasmacitrullin, en markör för fungerande enterocyter, korrelerar med toxicitet betyg och inflammatoriska markörer⁶ utöver absorptionsförmåga⁷, vilket tyder på denna aminosyra är en utmärkt biomarkör av mukosit. Citrullin kan mätas i både möss och råttor, och har visat utmärkta korrelationer med moderkaksprov längd⁸, Crypt Survival⁹, och strålningsinducerad mukosit¹⁰.

En stor fördel med att mäta plasma citrullin är förmågan att samla in upprepade mätningar från ett djur. Emellertid, flera blodprov i möss är begränsad till en total blodvolym på 6 μL/g/vecka och kräver allmän anestesi. Detta begränsar tyvärr också användningen av citrullin mätningar i möss. Dessutom kräver mätningen av citrullin högeffektiv vätskekromatografi^11,12, vilket är kostsamt och tidskrävande. Nyligen visade vi att citrullin nivåer hos möss korrelerar signifikant med SI vikt (p < 0,001) (opublicerade data), vilket gör citrullin en direkt mätning reflekterande enterocyte massa. En begränsning till mätningen av SI väger är nödvändigheten för mössen som ska offras, och thus inga upprepade mätningar inom den samma musen är möjligheten. Fortfarande metoden ger möjlighet att utföra en mängd andra vävnads analyser riktade till forskningsfrågan, och dessa fakta kan tänkas kompensera för den ytterligare användningen av djur. Vi föreslår därför att använda SI vikt som en enkel, låg kostnad, och snabb biomarkör för skador och anpassning hos möss. För att säkerställa reproducerbarhet och godtagbar analytisk variation bör tarmarna noga avlägsnas från djuret, spolas med saltlösning, tömmas och torkas före vägning. I den här artikeln visar vi exakt hur den här proceduren utförs.

Ett annat kännetecken för mukosit är förlusten av de prolifererande cellerna i kryptor och en kompenserande hyperproliferation under regenerativ period³. Den cellulära markör Ki67 har ofta används för att bestämma snabba proliferativa celler med hjälp av immunohistokemi¹³. Även om Ki67 är en enkel markör för spridning, den har en tendens till inexaktheter som Ki67 är närvarande under alla aktiva faser av cellcykeln (G1, S, G2, och M)¹⁴. Särskild märkning är nödvändig för att detektera replikerande celler, varför vi föreslår in situ inkorporering av 5-Bromo-2 ‘-deoxyuridine (BrdU), en syntetisk analog av tymidin, eftersom det är till stor del begränsad till att replikera celler i S-fas¹⁵. BrdU injiceras i djuren 150 minuter före avkall och celler kan därefter upptäckas med immunohistokemi med hjälp av BrdU-specifika antikroppar. I denna metod artikel, visar vi exakt hur man mäter området av BrdU immunpositiva celler inom en krypta med hjälp av en fri bildprogram vara.

Morfologiska och funktionella förändringar studeras ofta i 5-FU inducerad mukosit modeller, där intestinal anpassningen bedöms av moderkaksprov höjd och crypt djup. Under denna studie fann vi att under den akuta fasen av mukosit, vilket är lika med skade fasen, proliferation mätt med BrdU inkorporering är inte korrelerad med crypt djup. I motsats till detta, Crypt djup är signifikant korrelerad med proliferation ses i reparationsfasen av mukosit, 3 till 5 dagar efter induktion. Detta tyder på att den akuta fasen av mukosit inte är mätbara av crypt djup ensam. Vi föreslår att vid användning av proliferation som en Endpoint i den akuta fasen av mukosit möss, BrdU inkorporering bör helst användas men när kvantitera hyperproliferation i senare skede under regenerativ fas, Crypt djup är en rimlig alternativ till BrdU-inkorporering. Målet med denna studie var att beskriva denna modell på ett sätt som den kan användas av alla forskare, både inom onkologi men framförallt forskare som inte är bekanta med tarm skade modeller.

Den beskrivna modellen kan användas för att fenotyp transgena modeller enligt den adaptiva svar med hjälp av kroppsvikt, SI vikt och crypt djup som endpoints. Som ett exempel visar vi här hur vi använde modellen av 5-fluorouracil (5-FU) inducerad mukosit i en cellulär knock out-modell med otillräcklig L-cells sekretion¹⁶. Glukagon-liknande peptid-1 (GLP-1) och glukagon-liknande peptid-2 (GLP-2) är intestinala hormoner som utsöndras från de enteroendokrina L-celler som svar på födointag^17,18. GLP-2 är erkänd som en viktig faktor för intestinal healing, regleringen av slemhinnor apoptos och förbättring av barriärfunktion av Si^19,20,21,22. Baserat på litteraturen, vi hypotesen att endogena hormoner är nödvändiga för kompenserande hyperproliferation inträffar i adaptiv respons efter skada.

Protocol

Alla beskrivna metoder genomfördes i enlighet med riktlinjerna i dansk lagstiftning om djurförsök (1987). Studierna utfördes med tillstånd från den danska Animal experiment Inspectorate (2013-15-2934-00833) och den lokala etiska kommittén. Anmärkning: kvinnliga C57BL/6J möss (~ 20 − 25 g) erhölls och inrymt åtta per bur i standard 12 h ljus, 12 h mörk cykel med fri tillgång till vatten och standard Chow. Djuren lämnades att acklimatisera sig en vecka innan experiment började.<…

Representative Results

I det första experimentet, vi inducerade mukosit i möss på dag 0 och offrade en grupp möss varje dag för 5 dagar i följd. Vid mätning av SI-vikt, fann vi att denna parameter minskade från dag 2 till dag 4 tyder på en förlust i enterocyte massan. Vi fann också att SI-vikten vid dag 5 inte signifikant skiljer sig från dag 0 (obehandlade möss) (figur 1). Spridningen mätt genom införlivandet av BrdU var nästan avskaffades vid dag 1 och dag 2, men …

Discussion

Här visar vi en allmänt tillgänglig metod för att studera SI skada och förnyelse i en musmodell. Det finns ett brett utbud av prekliniska djurmodeller av tarm skador, men det är viktigt att vi förstår att varje modell är unik och att ändpunkterna måste vara lämpliga för att besvara forskningsfrågan. Denna modell är utmärkt att studera adaptiv svar på skada, men ändpunkterna bör ändras när du använder modellen som en preklinisk modell av mukosit. Men, översättning från djurmodeller till patienter …

Materials

5-Fluorouracil	Hospira Nordic AB, Sweden	137853
Ketaminol®Vet	Merck, New Jersey, USA	511485
Rompun®Vet Xylazine	Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany.	148999
10% nautral formalin buffer	Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom	BAF-5000-08A
HistoClear	National Diagnostics, United Kingdom	HS-200
Pertex	HistoLab®, Sweden	840
BrdU	Sigma-Aldrich, Germany.	B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer	Thermofisher scientific, Denmark	TA-125-PM4X
Peroxide Block	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
Rodent Block buffer	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody	Thermofisher Scientific, Denmark.	MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto	Thermofisher Scientific, Denmark.	TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate	DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen	DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition)	Carl Zeiss A/S		https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software	LOCI, University of Wisconsin		https://imagej.nih.gov/ij/