Trapianto intraventricolare di precursori neuronali ingegnerizzati per studi sulla neuroarchitettura In Vivo
Summary
Basato sull’ingegneria calularisa in vitro dei precursori neuronali, sul loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e sulla valutazione morbiterale accoppiata dei derivati “test” e “controllo”, questo metodo consente una modellazione accurata del controllo genico in vivo morfologia dei neuroni in modo semplice e conveniente.
Abstract
Il controllo genico della citoarchitettura neuronale è attualmente oggetto di indagini intensive. Descritto qui è un metodo semplice sviluppato per studiare il controllo genico in vivo della morfologia del neurone di proiezione neocorticale. Questo metodo si basa su (1) ingegneria lentivirale in vitro di precursori neuronali come cellule “test” e “controllo”, (2) il loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e (3) la valutazione morfometrica associata dei loro derivati neuronali. In particolare, a questo scopo vengono utilizzati precursori palliali E12.5 provenienti da donatori panneuronali, geneticamente etichettati. Sono progettati per sfruttare i promotori selezionati e la tecnologia tetON/OFF, e vengono trapiantati a mano libera in ventricoli laterali neoalari. Successivamente, al momento della profilazione immunofluorescenza dei cervelli riceventi, le sagome dei neuroni trapiantati vengono inserite nel software open source NeurphologyJ, vengono estratti i loro parametri morfometrici e vengono calcolati i dati di lunghezza e diramazione medici. Rispetto ad altri metodi, questo offre tre vantaggi principali: permette di ottenere un controllo fine dell’espressione transgenica a costi accessibili, richiede solo competenze chirurgiche di base e fornisce risultati statisticamente affidabili dopo l’analisi di un numero di animali. A causa del suo design, tuttavia, non è sufficiente affrontare il controllo non autonomo delle cellule della neuroarchitettura. Inoltre, dovrebbe essere preferibilmente usato per studiare il controllo della morfologia neurite dopo il completamento della migrazione neuronale. Nella sua formulazione attuale, questo metodo è squisitamente sintonizzato per studiare il controllo genetico dell’architettura neocorticale glutamatergica. Approfittando delle linee transgeniche che esprimono EGFP in altri tipi specifici di cellule neurali, può essere riutilizzato per affrontare il controllo genico della loro architettura.
Introduction
Qui descriviamo un semplice metodo che abbiamo sviluppato per sezionare il controllo genico in vivo della citoarchitettura neuronale. Basato sull’ingegneria in vitro dei precursori neuronali, il loro trapianto nel cervello neonale e la valutazione morfometrica accoppiata delle cellule “test” e “controllo”, permette di svelare implicazioni funzionali dei geni di prova nel controllo fine della morfologia neuronale in un modo veloce e conveniente. Per studiare il controllo genico in vivo dell’architettura neuronale, devono essere affrontate tre questioni tecniche chiave: (1) ottenere un’espressione gene of-interest (GOI) adeguatamente modellata e un controllo quantitativo accurato di essa; (2) ottenere una visualizzazione adeguatamente segmentata di sagome neuronali distinte; (3) suscitare un significato statistico dei risultati, impiegando un numero limitato di animali.
Quando disponibile, le linee mutanti di topo che ospitano transgeni controllati da tetraciclina (tet) possono essere lo strumento migliore per affrontare il primo numero1. In alternativa, può essere impiegata la transgenesi somatica. In questi casi, il transgene viene consegnato tramite elettroporazione2 o trasduzione virale3. Successivamente, viene mantenuto come esoma (ad esempio, su elettroporazione standard4), oppure è integrato nel genoma (casualmente, tramite integrasi retrovirale5; o in una posizione definita, tramite la ricombinazione omologa promossa da CRISPR (SLENDR)6 ).
In secondo luogo, la visualizzazione della silhouette neuronale può essere ottenuta tramite (a) etichettatura uniforme sparsa o (b) etichettatura differenziale densa. Per quanto riguarda l’etichettatura sparse, le metodologie avanzate simili a Golgi possono essere impiegate7, i miniset neuronali selezionati possono essere riempiti dalla biocitina8e l’etichettatura sale e pepe può essere ottenuta grazie a un transgene scarsamente espresso. Tale transgene può visualizzare la trascrizione variegata (Thy-EGFP)9 o può essere attivato da ricombinazione stocastica (MORF)10. Per quanto riguarda (b), le strategie all’avanguardia includono la ricombinazione stocastica mediata da Cre nell’ambito di un array transgene di fluoroproteina multi-floscio (Barcobalen)11, nonché l’integrazione genomica di semi-maschera-trasponesi dei geni della fluoroproteina, in precedenza tramite transgenesi somatica (CLoNE)12.
Per quanto riguarda il terzo numero, l’esito morfometrico è spesso influenzato da una grande variabilità casuale, originata da differenze tra animali e contingenze di iniezione cellulare. Per questo motivo, un gran numero di animali è di solito impiegato per ottenere il potere statistico necessario per valutare l’attività morfometrica GOI.
Gli approcci descritti in precedenza spesso si basano su competenze tecniche avanzate e richiedono risorse finanziarie cospicue, che possono limitare la loro diffusione all’interno della comunità scientifica. Per aggirare questi problemi, abbiamo concepito una pipeline semplice e diretta per sezionare il controllo genetico della neuroarchitettura in vivo in modo rapido e conveniente. Questo è ispirato da un design di co-trapianto simile precedentemente sviluppato per la valutazione veloce in vivo dell’attività transgenica antiblastica13.
In particolare, si pensa che il co-trapianto di precursori neurali “verdi” ingegnerizzati in vitro (“test” e cellule “controllo”) in un cervello neoatale ricevente “nero” possa risolvere contemporaneamente le tre questioni chiave sopra elencate. Infatti, in vitro lentivirale dei precursori, in condizioni ben controllate, consente il mantenimento della variabilità dell’espressione transgenica neuronale al minimo, molto al di sotto di quella solitamente associata a manipolazioni somatiche in vivo (eseguite in precedenza 14 Del sistema , 15 e nei nostri risultati inediti). Il controllo accurato risultante dell’espressione genica è paragonabile a quello ottenuto da modelli transgenici controllati da tet. Tuttavia, i costi di questa procedura sono di gran lunga inferiori a quelli derivanti dal mantenimento di una linea murina transgenica. Successivamente, l’iniezione di celle a mano libera è facile e richiede un addestramento minimo. Inoltre, la quantità di precursori etichettati iniettati in ogni cervello può essere facilmente messa a punto per ottenere un numero cumulativo sufficiente di precursori scarsamente distribuiti, mantenendo al contempo il numero totale di animali trapiantati. Infine, ma non meno importante, la coiniezione di diversi precursori con etichettatura fluoro, “test” e “controllo” e la successiva analisi statistica a coppie dei risultati contrastano gli effetti della variabilità sperimentale interanimale, consentendo il raggiungimento di significato statistico dei risultati, anche dopo l’analisi di un numero limitato di individui13.
Va sottolineato che, anche se veloce ed economico, questo metodo ha due limitazioni principali. In primo luogo, è progettato per studiare il controllo genico autonomo delle cellule dell’architettura neuronale e non è appropriato affrontare il controllo ambientale. In secondo luogo, poiché i precursori neuronali trapiantati raggiungono la loro posizione finale da un programma eterocronico, questo metodo è preferibile al controllo neuroarchitettonico modello che si verificano oltre il completamento della migrazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aspetti/passaggi specifici di questa procedura sono fondamentali e richiedono particolare attenzione. In primo luogo, (a) gli operatori devono essere adeguatamente addestrati per manipolare in modo sicuro i lentivirus in un ambiente di laboratorio conforme a BSL-2. In secondo luogo, (b) prima di mescolare “test” e “controllo” preparati neurali, è obbligatorio lavare attentamente le due sospensioni neurosfera corrispondenti come descritto, al fine di prevenire qualsiasi infezione incrociata ritardata dei due preparati a …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Mihn Duc Do per il suo contributo alla creazione anticipata di questa procedura.
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
References
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