I denne metode er embryonale hjerte væv bortopereret microdissected, adskilles, fluorescently mærket og implanteret i vært embryonale væv. Dette giver en platform for at studere de enkelte eller væv niveau udviklingsmæssige organisation under ektopisk hæmodynamiske forhold, og/eller ændret paracrine/juxtacrine miljøer.
Fortolkning af den relative virkning af celle autonome mønstre versus ydre microenvironmental indflydelse på celle lineage bestemmelse er en generel udfordring i udviklingsmæssige biologi forskning. I den embryonale hjerte, dette kan være særligt vanskeligt som regionale forskelle i udtryk for transcriptional regulatorer, paracrine/juxtacrine signaling cues, og hæmodynamiske kraft er alle kendt for at påvirke cardiomyocyte modning. En forenklet metode til at ændre en tredje cardiomyocyte molekylære og biomekaniske mikromiljø ville derfor tjene som en kraftfuld teknik til at undersøge, hvordan de lokale betingelser indflydelse celle skæbne og funktion. For at løse dette, har vi optimeret en metode for at fysisk transplant juvenile cardiomyocytes til ektopisk placeringer i hjertet eller den omkringliggende embryonale væv. Dette giver os mulighed at undersøge hvordan microenvironmental betingelser indflydelse cardiomyocyte skæbne overgange med enkelt celle opløsning inden for intakt embryonet. Her, beskriver vi en protokol, hvori embryonale myocytes kan være isoleret fra en bred vifte af cardiac sub-domæner, adskilles, fluorescently mærket og microinjected til værten embryoner med høj præcision. Cellerne kan derefter direkte analyseres på stedet ved hjælp af en række imaging og histologiske teknikker. Denne protokol er et stærkt alternativ til traditionelle podning eksperimenter, der kan være uoverkommeligt vanskeligt i en bevægende væv såsom hjertet. Generelle omridset af denne metode kan også tilpasses til en række donor væv og værtsmiljøer og sin brugervenlighed, lav pris, og hastighed gør det en potentielt nyttig anvendelse for en lang række udviklingsmæssige undersøgelser.
Hjerte udviklingsmæssige forskning har gavnet enormt fra fremkomsten af kønscelleoverførsel transgene modelsystemer, som har påvist mange af genet regulerende net at mønster forskellige celle lineages og funktionelle domæner i hjertet. Identificere kan hvordan disse genet netværk interagere med og reagere på microenvironmental betingelser, herunder paracrine/juxtacrine signaler og Biofysisk indgange (stræk, stamme, hæmodynamiske flow), dog være udfordrende. Som sådan, er det ikke altid let at afgøre, om en cellulær fænotype opstår som en direkte konsekvens af en genetisk undertrykkelse af netbårne eller som et sekundært resultat af en tilpasning til ændringer i hjertets biomekanik eller højere orden væv sammensætning1,2 .
Podning eksperimenter, som klassisk har været brugt til adresse begreber af skæbne specifikation, ville engagement, induktion og kompetence3,4, repræsentere en ideel metode til at omgå nogle af de udfordringer, der er forbundet med definere celle autonome versus miljømæssige indflydelse i hjertet. Desværre, hjertet sammentrækninger gøre standard podning metoder vanskeligt. Hurtig bevægelse af væv, ofte forhindrer podede celler i hjertet at overholde og store væv punkterer (normalt kræves til podning) ofte fører til hjertesvigt og embryonale dødelighed5,6,7. Derfor har vi udviklet et tryk-baseret, mikroinjektion system til præcision cellulære implantering i udviklingslandene chick hjertet, omgå de tekniske forhindringer af væv pode beskrevet tidligere8,9. Brug af denne teknik, kan individuelle eller små grupper af cardiac celler isoleret fra en donor embryoner være microinjected til en lang række regioner af en vært embryonale hjerte eliminerer behovet for omfattende vært forberedelse og de store væv fornærmelser, der opstår ved hjælp af podning standardteknikker. Mikroinjektion nåle bruges til disse implantation undersøgelser har en ydre diameter på ~ 30−40 µm, hvilket betyder, at nålen kan placeres direkte i målvævet (dvs. kan trænge embryonale Myokardie væggen) og celler kan leveres focally med minimale skader på det omgivende væv. Protokollen kan bruges til at udføre en række isotopiske, heterotopisk, isochor og heterochronic manipulationer, giver en hurtig, fleksibel og billig tilgang til direkte undersøge klassisk eksperimentelle embryologiske paradigmer i udviklingslandene fire-chambered hjerte.
I protokollen skitseret nedenfor, vi mærker donor celler med en celle permeant fluorescerende farvestof, som giver mulighed for succes af en mikroinjektion eksperiment at overvåge i realtid og placeringen af aflægger celler dokumenteres uden behov for nogen yderligere farvning. Dog skal det bemærkes, at denne fremgangsmåde er bedst egnet til at kortsigtede eksperimenter (ca. 48 h) som den fluorescerende farvestof kan gå tabt gennem celledeling. Alternative metoder kan bruges til længere sigt eksperimenter.
Mens vi præsenterer denne teknik i forbindelse med hjertets udvikling, har vi brugt det med stor effekt for celle implantation eksperimenter i mesoderm, hoved, lemmer og somites. Som sådan den grundlæggende fremgangsmåde beskrevet nedenfor er stærkt tractable og kan bruges i en række forskellige organsystemer.
Muligheden for at definere hvordan microenvironmental betingelser indvirkning hjerte celle skæbne specifikation og afstamning stabilisering er grundlæggende for at skabe en trykstyrke forståelse af medfødt hjertesygdom samt at udvikle effektive protokoller for korrekt modning af stamceller eller somatisk reprograming-baseret cardiomyocytes. Protokollen skitseret ovenfor giver efterforskerne evnen til at direkte assay hjerte celle udvikling under ændret in vivo betingelser, giver mulighed for celle autonome modning processer skal adskilles fra paracrine/juxtacrine og/eller hæmodynamiske stikord. Når det kombineres med høj opløsning imaging, genetisk analyse og fysiologiske assays, kan denne teknik tjene som et stærkt supplement til eksisterende transgene modeller.
Danne en teknisk stå punkt, protokollen præsenteres her er afhængig af effektiv isolation, mærkning og præcise implantering af donor hjertet celler i vært embryonale væv. Brugen af en mikroinjektion systemet høj grad hjælpemidler i målretning af donor celler og giver mulighed for vellykket implantation uden behov for at skabe en stor engraftment site i værten væv. Nogle operationelle færdigheder er nødvendig for at udføre denne teknik dog som reducerede rentabilitet kan resultere hvis injektion nålen ikke placeres omhyggeligt i målvævet (forårsager brud af hjertet eller lokale Vaskulaturen). Pleje og tanke bør også gives til isolation og mærkning trin. Over fordøjelsen af donor væv kan føre til dårlig implantation effektivitet, og forbigående mærkning teknikker kan begrænse tidsvinduet over som donor celler kan spores (som celledeling kan fortynde etiketten).
Denne teknik er meget modificerbare og kan tilpasses til mange forskellige formål. Eksempelvis blive donor celler fra et stort udvalg af væv og faser kan være isoleret (selvom optimering af enzymatisk fordøjelsen er påkrævet) og kan ligeledes injiceret i en bred vifte af værten væv på tværs af forskellige udviklingstrin. Ligeledes, den mærkning tilgang kan ændres til at spore celler på tværs af forskellige tidsmæssige vinduer, herunder brug af fluorescerende uorganiske halvleder-nanokrystaller for længere forbigående mærkning og implantation af vagtler celler eller af celler fra grøn fluorescerende proteiner transgene (normal god landbrugspraksis +) donor embryoner11 for permeant mærkning.
Mens vi i øjeblikket bruger denne teknik for aviær implantation undersøgelser, mener vi, at det kunne bruges til en lang række kimære undersøgelser i fremtiden. For eksempel kunne genmodificerede hjerte celler fra transgene organismer isoleret og microinjected ind i aviær hjertet ved hjælp af en meget lignende protokol. Derudover cellerne differentieres i cardiomyocytes fra stilke celler eller via reprograming tilgange i somatiske celler kunne være microinjected i embryonale hjertet til at evaluere deres integration i væv og/eller modning under in vivo biomekaniske betingelser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud R00HL122360 fra National Institutes of Health, National Heart, Lung, og Blood Institute (NHLBI).
1 mL Insulin Syringe | BD | 329654 | |
1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 24-282 | |
10 ml Syringe | BD | 305482 | |
1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-430 | |
15 mL Centriguge Tubes, Racked | Genesee Scientific | 28-101 | |
1588 Genesis Hova-Bator Incubator | GQF | 813927021221 | |
18G x 1 1/2 Needle | BD | 305196 | |
200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-412 | |
32G x 1/2" Needle | TSK Steriject Air-Tite | TSK3213 | |
Alchohol Wipes 70% | Thermo Fisher Scientific | 19015744 | |
Angled Forceps | Fine Scientific Tools | 11260-20 | |
Backloading Tips | Eppendorf | 930001007 | |
Black India Ink | KOH-I-NOOR | 3084-F | |
CellTracker Green CMF | Thermo Fisher Scientific | C7025 | 1 mM in DMSO |
CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 1 mM in DMSO |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Commercial Grade Packing Tape | Staples | 2619001 | |
Curved Tenotomy Scissors | Fine Scientific Tools | 14067-11 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
DMSO, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000021 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | |
Hatching Eggs | Pilgrim's Hatchery | — | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
Injectman 4 | Eppendorf | 5192000027D | |
Micromanipulator | Leica Microsystems | — | |
Parafilm | SIGMA | P6543-1EA | |
Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 100496-496 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-022 | |
Petri Dish | Genesee Scientific | 32-107 | |
Pipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
Pipette Puller | HEKA | PIP 6 | |
Scotch Transparent Tape | Staples | 487909 | |
Sigmacote | SIGMA | SL2-25ML | |
Stereo Microscope | Leica | — | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
Transfer Pipette | Thermo Fisher Scientific | 273 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 |