इस विधि में, भ्रूण कार्डिएक ऊतकों शल्य चिकित्सा microdissected, असंबद्ध, फ्लोरोसेंट लेबल, और मेजबान भ्रूण के ऊतकों में प्रत्यारोपित कर रहे हैं । यह अस्थानिक hemodynamic शर्तों के तहत व्यक्तिगत या ऊतक स्तर के विकासात्मक संगठन का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करता है, और/या बदल paracrine/juxtacrine वातावरण ।
सेल वंश निर्धारण पर बाह्य microenvironmental प्रभाव बनाम कोशिका स्वायत्त पैटर्न के सापेक्ष प्रभाव की व्याख्या विकास जीव विज्ञान अनुसंधान में एक सामांय चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है । भ्रूण दिल में, यह transcriptional नियामकों की अभिव्यक्ति में क्षेत्रीय मतभेदों के रूप में विशेष रूप से मुश्किल हो सकता है, paracrine/juxtacrine संकेतन cues, और hemodynamic बल सभी cardiomyocyte परिपक्वता को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है । एक सरल तरीका है एक विकासशील है cardiomyocyte आणविक और यांत्रिक microenvironment को बदलने के लिए, इसलिए, एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में सेवा के लिए जांच कैसे स्थानीय शर्तों सेल भाग्य और समारोह को प्रभावित करते हैं । इस पते के लिए, हम शारीरिक रूप से हृदय या आसपास के भ्रूण ऊतक में अस्थानिक स्थानों में किशोर cardiomyocytes प्रत्यारोपण करने के लिए एक विधि को अनुकूलित किया है । यह हमें की जांच करने के लिए कैसे microenvironmental शर्तों बरकरार भ्रूण के भीतर एक सेल प्रस्ताव पर cardiomyocyte भाग्य संक्रमण को प्रभावित करने की अनुमति देता है । यहां, हम एक प्रोटोकॉल जिसमें भ्रूण myocytes हृदय उप की एक किस्म से अलग किया जा सकता का वर्णन डोमेन, असंबद्ध, फ्लोरोसेंट लेबल, और उच्च परिशुद्धता के साथ मेजबान भ्रूण में microinjected । कोशिकाओं को तो सीधे सीटू में इमेजिंग और ऊतकवैज्ञानिक तकनीक की एक किस्म का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल पारंपरिक भ्रष्टाचार करने वाले प्रयोगों कि दिल के रूप में एक चलती ऊतक में मुश्किल नकारात्मक स्तर तक जा सकता है के लिए एक शक्तिशाली विकल्प है । इस विधि की सामांय रूपरेखा भी दाता ऊतकों और मेजबान वातावरण की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और उसके उपयोग की आसानी, कम लागत, और गति यह विकास के अध्ययन की एक किस्म के लिए एक संभावित उपयोगी अनुप्रयोग बनाते हैं ।
कार्डिएक विकास अनुसंधान germline ट्रांसजेनिक मॉडल प्रणाली है जो जीन विनियामक नेटवर्क है कि पैटर्न विभिंन कोशिका वंश और दिल में कार्यात्मक डोमेन के कई की पहचान की है के आगमन से काफी लाभांवित किया है । हालांकि, पहचान कैसे इन जीन नेटवर्क के साथ बातचीत और paracrine/juxtacrine संकेतों और भौतिक आदानों (खिंचाव, तनाव, hemodynamic प्रवाह) सहित microenvironmental शर्तों का जवाब, चुनौतीपूर्ण हो सकता है । जैसे, यह हमेशा आसान नहीं है कि क्या एक सेलुलर phenotype एक आनुवंशिक गड़बड़ी के एक प्रत्यक्ष परिणाम के रूप में या कार्डियक मैकेनिक या उच्चतर आदेश ऊतक संरचना1,2 में परिवर्तन करने के लिए एक अनुकूलन के एक माध्यमिक परिणाम के रूप में उठता है कि निर्धारित करने के लिए .
भ्रष्टाचारी प्रयोगों, जो क्लासिक भाग्य विनिर्देश, प्रतिबद्धता, प्रेरण, और क्षमता3,4की अवधारणाओं को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है में निहित चुनौतियों में से कुछ को दरकिनार करने के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करेंगे परिभाषित सेल स्वायत्त बनाम पर्यावरण के प्रभाव में दिल । दुर्भाग्य से, हृदय संकुचन मानक कठिन दृष्टिकोण भ्रष्टाचार कर रहे हैं । ऊतक के तेजी से आंदोलन अक्सर दिल और बड़े ऊतक पंचर का पालन करने से भ्रष्टाचार कोशिकाओं को रोकता है (आम तौर पर भ्रष्टाचार के लिए आवश्यक) अक्सर दिल की विफलता और भ्रूण मृत्यु दर5,6,7के लिए नेतृत्व । इसलिए, हम विकसित किया है एक दबाव आधारित, microinjection प्रणाली के लिए परिशुद्धता सेलुलर आरोपण विकासशील चिकी दिल में, पहले8,9वर्णित भ्रष्टाचार ऊतक के तकनीकी बाधाओं को दरकिनार. इस तकनीक का प्रयोग, व्यक्तिगत या कार्डियक एक दाता भ्रूण से पृथक कोशिकाओं के छोटे समूहों के एक मेजबान भ्रूण व्यापक मेजबान की तैयारी और बड़े ऊतक अपमान है कि का उपयोग कर उठता के लिए की जरूरत को नष्ट करने के दिल के क्षेत्रों की एक किस्म में microinjected जा सकता है मानक कलम बांधने की तकनीक । इन आरोपण अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया सुई microinjection के एक बाहरी व्यास है ~ 30 − 40 µm, जिसका मतलब है कि सुई सीधे लक्ष्य ऊतक में रखा जा सकता है (यानी, भ्रूण रोधगलन दीवार घुसना कर सकते हैं) और कोशिकाओं को फोकल के साथ दिया जा सकता है आसपास के ऊतकों को न्यूनतम क्षति. प्रोटोकॉल के लिए isotopic, heterotopic, isochoric, और heterochronic जोड़तोड़ की एक किस्म का प्रदर्शन किया जा सकता है, एक तेजी से, लचीला, और कम लागत दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए सीधे विकासशील में शास्त्रीय प्रयोगात्मक embryological मानदंड की जांच चार चैंबर दिल ।
प्रोटोकॉल में नीचे उल्लिखित, हम एक सेल permeant फ्लोरोसेंट डाई, जो एक microinjection प्रयोग की सफलता के लिए अनुमति देता है के साथ दाता कोशिकाओं लेबल में वास्तविक समय और engrafted कोशिकाओं के स्थान पर नजर रखने के लिए किसी भी अतिरिक्त के लिए की आवश्यकता के बिना प्रलेखित होना धुंधला. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस दृष्टिकोण सबसे अच्छा अल्पकालिक प्रयोगों के लिए अनुकूल है (लगभग ४८ ज) फ्लोरोसेंट डाई के रूप में सेल विभाजन के माध्यम से खो दिया जा सकता है । वैकल्पिक दृष्टिकोण अब अवधि के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
जब तक हम हृदय विकास के संदर्भ में इस तकनीक को पेश कर रहे हैं, हम इसे मध्य त्वक स्तर, सिर, अंगों में सेल आरोपण प्रयोगों के लिए महान प्रभाव के लिए इस्तेमाल किया है, और somites । के रूप में इस तरह के बुनियादी दृष्टिकोण नीचे वर्णित अत्यधिक है और योग्य अंग प्रणालियों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
को परिभाषित करने की क्षमता कैसे microenvironmental स्थितियों प्रभाव कार्डियक सेल भाग्य विनिर्देश और वंश स्थिरीकरण जन्मजात हृदय रोग का एक संपीड़न समझ बनाने के साथ ही उचित के लिए कुशल प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए मौलिक है स्टेम सेल या दैहिक कोशिका reprograming आधारित cardiomyocytes की परिपक्वता । ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को सीधे vivo परिस्थितियों में परिवर्तित के तहत हृदय कोशिका विकास परख करने की क्षमता देता है, सेल स्वायत्त परिपक्वता प्रक्रियाओं के लिए अनुमति paracrine/juxtacrine और/या hemodynamic cues से अलग हो । जब उच्च संकल्प इमेजिंग, आनुवंशिक विश्लेषण, और शारीरिक परख के साथ संयुक्त, इस तकनीक को मौजूदा ट्रांसजेनिक मॉडल के लिए एक शक्तिशाली पूरक के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
एक तकनीकी स्टैंड बिंदु फार्म, प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत कुशल अलगाव, लेबल, और मेजबान भ्रूण के ऊतकों में दाता दिल की कोशिकाओं के सटीक आरोपण पर निर्भर करता है । एक microinjection प्रणाली का उपयोग बहुत दाता कोशिकाओं के लक्ष्यीकरण में एड्स और मेजबान ऊतक में एक बड़ी engraftment साइट बनाने के लिए की आवश्यकता के बिना सफल आरोपण के लिए अनुमति देता है । कुछ संचालन कौशल इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है, लेकिन, के रूप में कम व्यवहार्यता परिणाम कर सकते है अगर इंजेक्शन सुई ध्यान लक्ष्य ऊतक में रखा नहीं है (दिल या स्थानीय vasculature के टूटना के कारण) । ध्यान और विचार भी अलगाव और लेबलिंग कदम के लिए दिया जाना चाहिए । दाता ऊतक के पाचन पर गरीब आरोपण दक्षता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और क्षणिक लेबलिंग तकनीक समय खिड़की जो दाता कोशिकाओं पर नज़र रखी जा सकता है सीमा (के रूप में सेल विभाजन लेबल को कमजोर कर सकते हैं) ।
इस तकनीक उच्च परिवर्तनीय है और प्रयोजनों के एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, ऊतकों और चरणों की एक बड़ी रेंज से दाता कोशिकाओं अलग किया जा सकता है (हालांकि एंजाइमी पाचन के अनुकूलन की आवश्यकता है) और इसी तरह विकास के विभिंन चरणों में मेजबान ऊतकों की एक किस्म में इंजेक्ट किया जा सकता है । इसी तरह, लेबलिंग दृष्टिकोण को विभिंन लौकिक खिड़कियों भर में कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, फ्लोरोसेंट अकार्बनिक अर्धचालक nanocrystals के उपयोग के लिए अब क्षणिक लेबलिंग और बटेर कोशिकाओं या हरे रंग से कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए सहित फ्लोरोसेंट प्रोटीन ट्रांसजेनिक (GFP +) permeant लेबलिंग के लिए दाता भ्रूण11 ।
जब तक हम वर्तमान में एवियन आरोपण के अध्ययन के लिए इस तकनीक का उपयोग करें, हमें लगता है कि यह भविष्य में chimeric अध्ययन की एक बड़ी रेंज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, आनुवंशिक रूप से बदल ट्रांसजेनिक जीवों से कार्डियक कोशिकाओं अलग किया जा सकता है और एवियन दिल में microinjected एक बहुत ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर । इसके अलावा, कोशिकाओं उपजी कोशिकाओं से cardiomyocytes में विभेदित या दैहिक कोशिका reprograming दृष्टिकोण के माध्यम से भ्रूण दिल में microinjected जा सकता है ऊतक में उनके एकीकरण का मूल्यांकन करने के लिए और/ शर्तों.
The authors have nothing to disclose.
यह काम स्वास्थ्य, राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े, और रक्त संस्थान (NHLBI) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान R00HL122360 द्वारा समर्थित किया गया था ।
1 mL Insulin Syringe | BD | 329654 | |
1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 24-282 | |
10 ml Syringe | BD | 305482 | |
1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-430 | |
15 mL Centriguge Tubes, Racked | Genesee Scientific | 28-101 | |
1588 Genesis Hova-Bator Incubator | GQF | 813927021221 | |
18G x 1 1/2 Needle | BD | 305196 | |
200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-412 | |
32G x 1/2" Needle | TSK Steriject Air-Tite | TSK3213 | |
Alchohol Wipes 70% | Thermo Fisher Scientific | 19015744 | |
Angled Forceps | Fine Scientific Tools | 11260-20 | |
Backloading Tips | Eppendorf | 930001007 | |
Black India Ink | KOH-I-NOOR | 3084-F | |
CellTracker Green CMF | Thermo Fisher Scientific | C7025 | 1 mM in DMSO |
CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 1 mM in DMSO |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Commercial Grade Packing Tape | Staples | 2619001 | |
Curved Tenotomy Scissors | Fine Scientific Tools | 14067-11 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
DMSO, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000021 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | |
Hatching Eggs | Pilgrim's Hatchery | — | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
Injectman 4 | Eppendorf | 5192000027D | |
Micromanipulator | Leica Microsystems | — | |
Parafilm | SIGMA | P6543-1EA | |
Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 100496-496 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-022 | |
Petri Dish | Genesee Scientific | 32-107 | |
Pipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
Pipette Puller | HEKA | PIP 6 | |
Scotch Transparent Tape | Staples | 487909 | |
Sigmacote | SIGMA | SL2-25ML | |
Stereo Microscope | Leica | — | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
Transfer Pipette | Thermo Fisher Scientific | 273 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 |