线虫的耗氧率测定
Summary
线粒体呼吸对组织的生存至关重要;因此, 耗氧率是线粒体健康的一个很好的指标。在这个协议中, 我们描述了使用一个商业上可用的呼吸计来测量基本和最大耗氧率的活, 完整, 和自由运动的。
Abstract
最佳线粒体功能对健康的细胞活动至关重要, 特别是在神经系统和肌肉等能量需求较高的细胞中。与此相一致的是, 线粒体功能障碍与无数的神经退行性疾病和一般的衰老有关。线虫是阐明线粒体功能的许多复杂问题的有力模型系统。线粒体呼吸是线粒体功能的强大指标, 最近开发的呼吸计为测量细胞呼吸提供了一个最先进的平台。在这个协议中, 我们提供了一种分析活的、完整的线虫的技术。该协议跨越约7天的时间, 包括 (1) 线虫生长和同步的步骤, (2) 制备注入的化合物和探针的水合作用, (3) 药物装载和弹药筒平衡, (4) 制备蠕虫试验板和分析运行, 以及 (5) 实验后数据分析。
Introduction
三磷酸腺苷 (atp) 是细胞能量的主要来源, 是由位于线粒体内膜内的电子传输链 (etc) 中的酶在线粒体中产生的。丙酮酸是用于线粒体 atp 生产的一种关键代谢物, 被导入线粒体基质中, 在那里它被脱羧化, 以产生乙酰辅酶 a (coenzyme)。随后, 乙酰 coa 进入柠檬酸循环, 导致烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nadh) 的产生, 这是一个关键的电子载体分子。当来自 nadh 的电子通过 etc 传递到氧气时, 质子就会在线粒体膜间空间中积累, 从而导致整个膜产生一个电化学梯度。然后, 这些质子将通过这个电化学梯度从膜间空间流回线粒体基质, 通过 atp 合成酶的质子孔, 推动其旋转和 atp1的合成 (图 1)。
线粒体功能不仅限于能量的产生, 而且对钙的稳态、活性氧的清除和凋亡也至关重要, 关键的是将其功能定位在组织健康中 2.线粒体功能可以使用多种检测方法进行评估, 包括但不限于测量线粒体膜电位、atp 和 ros 水平以及线粒体钙浓度的分析。然而, 这些检测提供了线粒体功能的单一快照, 因此可能无法提供线粒体健康的全面视图。由于 atp 生成过程中的耗氧量依赖于无数的连续反应, 因此它是线粒体功能的一个优越指标。有趣的是, 由于线粒体功能障碍3,4,5, 已经观察到氧气消耗率的变化。
活样品的耗氧率 (ocr) 可以通过可大致分为两类的技术来测量: 安培氧传感器和基于斑岩的荧光粉, 它们可以通过氧6淬火.安培氧传感器已被广泛用于测量 ocr 在培养的细胞, 组织, 和模型系统, 如线虫。然而, 含有呼吸计的基于斑林的荧光粉具有以下优点: (1) 它们允许对两个样品进行三式三份的并排比较, (2) 它们需要较小的样本尺寸 (例如, 每口井20头蠕虫, 而在 2000-500只室)7, 和 (3) 呼吸计可以编程做四个不同的复合注射在整个实验运行的理想时间, 无需手动应用。
在该协议中, 描述了使用基于斑林的氧传感呼吸计测量 ocr 在活的, 完整的线虫所涉及的步骤.虽然有一个书面协议的使用大格式, 高吞吐量呼吸计 8, 该协议已被调整为使用更经济友好, 易于访问, 和较小的规模的仪器。该协议对于评估两个菌株之间的 ocr 差异特别有用, 因为在这两个菌株中不需要高通量筛选, 并且其使用过多。
Protocol
Representative Results
Discussion
线粒体呼吸是线粒体功能的一个有见地的指标;因此, 能够测量生物系统中的耗氧率, 无论是在体外还是体内, 都是非常有价值的。呼吸计使用基于斑啉的荧光粉检测氧气水平, 这些荧光粉通过氧或依靠产生与氧气压力成正比的电流的安培氧传感器淬火。克拉克电极属于后一类, 在文献中得到了广泛的应用, 特别是在分析线虫的呼吸时。然而, 由于需要较大的样品尺寸和无法一次评估多个样品, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者们要感谢凯文·比特曼博士在实验室建立海马 xfp 方面的指导。国家卫生研究院 gm088213 支持这项工作。
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
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