Måling af ilt forbrug satser i intakt Caenorhabditis elegans
Summary
Mitokondrie respiration er kritisk for kropsligt overlevelse; ilt forbrugssats er derfor en udmærket indikator for mitokondrie sundhed. I denne protokol, vi beskriver brugen af en kommercielt tilgængelig respirometer at måle basal og maksimal ilt forbrug satser i live, intakt og frit motile Caenorhabditis elegans.
Abstract
Optimal mitokondrie funktion er afgørende for sund cellulære aktivitet, især i celler, der har høj energi krav som i nervesystemet og muskel. Overensstemmelse med dette, mitokondriel dysfunktion har været forbundet med et utal af neurodegenerative sygdomme og aldring i almindelighed. Caenorhabditis elegans har været et kraftfuld model for belyse de mange snørklede af mitokondrie-funktionen. Mitokondrie respiration er en stærk indikator for mitokondrie funktion og nyligt udviklede respirometers tilbyder en state-of-the-art platform for at måle åndedræt i celler. I denne protokol giver vi en teknik til at analysere levende, intakt C. elegans. Denne protokol spænder over en periode på ~ 7 dage og omfatter trin for (1) vokser og synkronisering af C. elegans, (2) udarbejdelse af forbindelser skal injiceres og hydrering af sonder, (3) stoffet lastning og patron ækvilibrering, (4) udarbejdelsen af ormen assay plade og assay køre og (5) efter eksperiment dataanalyse.
Introduction
Adenosin trifosfat (ATP), den vigtigste kilde til cellulære energi, er produceret i mitokondrier af enzymer i transportkæden, elektron (osv) placeret i den indre mitokondrielle membran. Pyruvat, en central metabolit udnyttet til mitokondrie ATP produktion, der importeres til den mitokondriets matrix, hvor det er decarboxylated til at producere acetyl coenzym A (CoA). Efterfølgende træder acetyl CoA citronsyrecyklus resulterer i generation af nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH), en nøgle elektron luftfartsselskab molekyle. Da elektroner fra NADH overføres til ilt via ETC, hober protoner sig op i den mitokondrielle intermembrane plads, hvilket resulterer i dannelsen af en elektrokemisk gradient på tværs af membranen. Disse protoner vil derefter strømme fra det intermembrane rum på tværs af denne elektrokemiske gradient tilbage ind i mitokondriets matrix gennem proton pore af ATPsyntase, køre sin rotation og syntese af ATP1 (figur 1).
Mitokondrie-funktion er ikke begrænset til energiproduktion, men er også afgørende for calcium homeostase, reaktive ilt arter (ROS) latrintømning og apoptose, kritisk positionering deres funktion i kropsligt sundhed2. Mitokondrie-funktion kan vurderes ved hjælp af en række assays, herunder men ikke begrænset til analyser, der måler mitokondrielle membran potentiale, ATP og ROS niveauer og mitokondriel calcium koncentrationer. Men disse assays giver et enkelt snapshot af mitokondrie funktion og derfor måske ikke giver en omfattende visning af mitokondrie sundhed. Da iltforbrug under ATP generation er afhængige af et utal af sekventielle reaktioner, tjener det som en overlegen indikator af mitokondrie-funktionen. Interessant, er blevet observeret variationer i ilt forbrug satser som følge af mitokondriel dysfunktion3,4,5.
Ilt forbrug satser (OCR) af levende prøver kan måles ved hjælp af teknikker, som kan groft inddeles i to grupper: amperometric ilt sensorer og porfyrin-baserede fosfor, der kan blive slukket af ilt6. Amperometric ilt sensorer har været udbredt foranstaltning OCR i kulturperler celler, væv, og i modelsystemer, som C. elegans. Dog porfyrin-baserede fosforer indeholdende respirometers besidder følgende fordele: (1) de tillader en side om side sammenligning af to stikprøver i tre eksemplarer, (2) de kræver mindre stikprøvestørrelse (f.eks. 20 orm pr. brønd versus ~ 2, 000−5, 000 orme den afdeling)7, og (3) respirometer kan programmeres til at gøre fire forskellige foderblandinger injektioner på ønskede gange hele den eksperimentelle run, eliminerer behovet for manuel påføring.
I denne protokol er trin involveret i at bruge en porfyrin-baserede ilt-sensing respirometer foranstaltning OCR i levende, intakt C. elegans beskrevet. Mens der er en skriftlig protokol for brugen af det store format, høj overførselshastighed respirometer8, er denne protokol blevet tilpasset til brug med en mere budget venligt, tilgængeligt og mindre skala instrument. Denne protokol er især nyttig for at vurdere forskellen i OCR mellem to stammer, hvor høj overførselshastighed screening er ikke påkrævet og dets anvendelse ville være overdrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondrie respiration er en indsigtsfuld indikator af mitokondrie funktion; Derfor er at være i stand til at måle ilt forbrug satser i et biologisk system, om in vitro- eller in vivo meget værdifuld. Respirometers fornemmer ilt niveauer ved hjælp af porfyrin-baserede fosfor, at få slukket af ilt eller via amperometric ilt sensorer, der er baseret på generation af en elektrisk nuværende proportional med ilt pres. Clark elektrode falder ind under sidstnævnte kategori og er blevet brugt flittigt i litteratur, isæ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Kevin Bittman for hans vejledning i oprettelse af Seahorse XFp i laboratoriet. National Institutes of Health giver GM088213 støttet dette arbejde.
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
- Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
- Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
- Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
- Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents–carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer’s disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. 생화학. 51, 2959-2973 (2012).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. 유전학. 201, 1453-1466 (2015).
