Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans
Summary
Mitochondriale Atmung ist entscheidend für das organismal überleben; Sauerstoff-Verbrauch ist daher ein hervorragender Indikator für mitochondriale Gesundheit. In diesem Protokoll wir beschreiben die Verwendung von handelsüblichen Respirometer basale messen und maximale Sauerstoff-Verbrauch im Leben, intakt und frei bewegliche Caenorhabditis Elegans.
Abstract
Optimale Funktion der Mitochondrien ist wichtig für gesunde Zellaktivität, besonders in Zellen mit hohem Energiebedarf wie in das Nervensystem und Muskel. Einklang mit diesem, wurde mitochondriale Dysfunktion assoziiert mit einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen und Altern im Allgemeinen. Caenorhabditis Elegans wurden mächtige Modellsystem für die Aufklärung der vielen Feinheiten der mitochondrialen Funktion. Mitochondriale Atmung ist ein starker Indikator für die Funktion der Mitochondrien und neu entwickelte Respirometers bieten eine State-of-the-Art Plattform, um die Atmung in den Zellen zu messen. In diesem Protokoll bieten wir eine Technik, um live, intakte C. Eleganszu analysieren. Dieses Protokoll umfasst einen Zeitraum von ~ 7 Tage und umfasst Schritte für (1) wachsen und Synchronisation von C. Elegans (2) Vorbereitung von Verbindungen injiziert werden und Hydratation der Sonden, be- und Patrone Gleichgewichtherstellung Medikament (3), (4) Vorbereitung der Wurm assay Platte und Assay laufen und (5) nach dem Experiment Datenanalyse.
Introduction
Adenosintriphosphat (ATP), die Hauptquelle der Zellenergie, wird durch Enzyme in der Elektronentransport-Kette (etc.) befindet sich in der inneren mitochondrialen Membran in den Mitochondrien produziert. Pyruvat, eine wichtige Metaboliten genutzt für mitochondriale ATP-Produktion, wird in der mitochondrialen Matrix importiert es decarboxyliert ist, Acetyl Coenzym A (CoA) zu produzieren. Acetyl-CoA tritt anschließend der Zitronensäure-Zyklus, was bei der Erzeugung von Nicotinamid Adenin Dinucleotide (NADH), eine wichtige Elektron Trägermolekül. Da Elektronen von NADH zu Sauerstoff über die usw. übergeben werden, aufbauen Protonen in die mitochondriale Intermembran Raum, die Ergebnisse in der Generation eines elektrochemischen Gradienten durch die Membran. Diese Protonen fließt dann aus dem Intermembran Raum in diesem elektrochemischen Gradienten zurück in der mitochondrialen Matrix durch die Proton-Pore des ATP-Synthase, fahren die Rotation und die Synthese von ATP1 (Abbildung 1).
Mitochondriale Funktion beschränkt sich nicht nur zur Energiegewinnung sondern ist auch entscheidend für die Kalzium-Homöostase, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) aufräumen und Apoptose, kritisch Positionierung ihrer Funktion im organismal Gesundheit2. Mitochondriale Funktion kann mit einer Vielzahl von Tests, einschließlich aber nicht beschränkt auf Analysen, die mitochondriale Membranpotential messen, ATP und ROS Ebenen und mitochondriale Kalzium-Konzentrationen bewertet werden. Jedoch diese Assays zur Verfügung stellen einer Momentaufnahme der mitochondrialen Funktion und daher möglicherweise nicht bietet einen umfassenden Überblick der mitochondrialen Gesundheit. Da Sauerstoff-Verbrauch bei der ATP-Generierung auf eine Vielzahl von sequentiellen Reaktionen angewiesen ist, dient es als eine überlegene Indikator für die Funktion der Mitochondrien. Interessanterweise sind Variationen in Sauerstoff-Verbrauch durch mitochondriale Dysfunktion3,4,5beobachtet worden.
Sauerstoff-Verbrauch (OCR) von lebenden Proben gemessen werden, mit Techniken, die im großen und ganzen in zwei Gruppen eingeteilt werden können: amperometrischen Sauerstoffsensoren und Porphyrin-basierte Leuchtstoffe, die durch Sauerstoff6gestillt werden können. Amperometrischen Sauerstoffsensoren sind weitgehend nach Maß OCR in kultivierten Zellen, Geweben, und Modellsysteme, wie C. Elegansbenutzt worden. Porphyrin-basierte Phosphore mit Respirometers besitzen jedoch folgende Vorteile: (1) sie ermöglichen eine Gegenüberstellung zweier Proben in dreifacher Ausfertigung, (2) sie benötigen kleinere Stichprobengröße (z. B. 20 Würmer pro Bohrloch im Vergleich zu ~ 2, 000−5, 000 Würmern, in der Zeiten während der experimentellen ausführen, wodurch die Notwendigkeit für manuelle Anwendung gewünscht Kammer)7, und (3) der Respirometer kann programmiert werden, dazu vier verschiedene zusammengesetzte Injektionen an.
In diesem Protokoll sind Schritte im Umgang mit einem Porphyrin-basierte Sauerstoff-Sensor Respirometer Maßnahme OCR in live, intakte C. Elegans beschrieben. Zwar gibt es ein schriftliches Protokoll für die Verwendung von großformatigen, Hochdurchsatz Respirometer8, wurde dieses Protokoll für die Verwendung mit einem mehr Budget-freundlich, zugänglich und kleineren Maßstab-Instrument angepasst. Dieses Protokoll eignet sich besonders für die Beurteilung des Unterschied in OCR zwischen zwei Stämmen, wo Hochdurchsatz-Screening ist nicht erforderlich und seine Verwendung wäre übertrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitochondriale Atmung ist eine aufschlussreiche Indikator für die Funktion der Mitochondrien; Daher ist es sehr wertvoll, in der Lage, den Sauerstoff-Verbrauch in einem biologischen System, ob in vitro oder in vivo zu messen. Respirometers spüren Sauerstoffgehalt mit Porphyrin-basierte Leuchtstoffe, die durch Sauerstoff oder über amperometrischen Sauerstoffsensoren, die auf die Erzeugung von einer elektrischen aktuelle Proportional zur Sauerstoffdruck gestillt bekommen. Clark-Elektrode fällt in diese Kategorie und wu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Dr. Kevin Bittman für seine Führung bei der Festlegung der Seepferdchen XFp im Labor zu bestätigen. National Institutes of Health zu gewähren, dass GM088213 diese Arbeit unterstützt.
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
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