그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정
Summary
미토 콘 드리 아 호흡은 중요 organismal 생존; 따라서, 산소 소비 속도 미토 콘 드리 아 건강의 훌륭한 지표 이다. 이 프로토콜에 기저 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 respirometer 사용 하 여 설명 하 고 최대 산소 소비 속도에 라이브, 그대로, 그리고 자유롭게 운동 꼬마 선 충.
Abstract
미토 콘 드리 아 기능을 최적의 건강 한 세포 활동, 특히 높은 에너지 요구 같은 신 경계와 근육에 있는 셀에에서 대 한 중요 하다. 일관 된,이 미토 콘 드 리아 기능 장애 신경 퇴행 성 질환 및 일반적으로 노화의 무수와 연결 되었습니다. 꼬마 선 충 elucidating 미토 콘 드 리아 기능의 많은 복잡 한에 대 한 강력한 모델 시스템 되었습니다. 미토 콘 드리 아 호흡 미토 콘 드리 아 기능의 강한 지시자 이다 고 최근에 개발 된 respirometers 세포에서 호흡을 측정 하는 최신의 플랫폼을 제공 합니다. 이 프로토콜, 라이브, 그대로 C. 선 충을 분석 하는 기술을 제공 합니다. 이 프로토콜 ~ 7 일의 기간에 걸쳐 (1) 성장 하 고 주입 하는 화합물의 C. 선 충, (2) 준비 및 프로브, (3) 약물 로드 및 카트리지 평형, 웜 분석 결과의 준비 (4) 수 분의 동기화에 대 한 단계를 포함 하 고 플레이트 및 실행, 분석 결과 (5) 후 실험 데이터 분석.
Introduction
아데노신 3 인산 염 (ATP), 세포 에너지의 주요 소스는 미토 콘 드리 아에 안 미토 콘 드리 아 막에 위치한 전자 전송 체인 (등)에서 효소에 의해 생산 됩니다. 어디 그것 decarboxylated 아 세 틸 보 효소 A (CoA)를 생산 하는 미토 콘 드리 아 모체로 pyruvate, 미토 콘 드리 아의 ATP 생산을 위해 활용 하는 주요 대사 산물 가져옵니다. 그 후, 아 세 틸 CoA 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH)는 주요 전자 캐리어 분자의 세대의 결과로 구 연산 산 성 주기를 입력 합니다. NADH에서 전자는 등을 통해 산소에 전달 됩니다, 양성자 전기 화학 기온 변화도의 세대에서 막에 걸쳐 결과 미토 콘 드 리아 intermembrane 공간에 구축. 이러한 양성자 것입니다 다음 회전 그리고 ATP1 (그림 1)의 합성 ATP synthase의 양성자 기 공 통해 미토 콘 드리 아 모체로 다시이 전기 화학 기온 변화도 걸쳐 intermembrane 공간에서 흐른다.
미토 콘 드 리아 기능 에너지 생산에 국한 되지 않습니다 하지만 칼슘 항상성, 반응성 산소 종 (선생님), 청소 및 apoptosis, organismal 건강2에 그들의 기능을 비판적으로 위치에 대 한 중요 한 또한 이다. 미토 콘 드 리아 기능 분석 실험를 포함 하 여 그 미토 콘 드리 아 막 잠재력 측정 분석, ATP 및 선생님 수준, 그리고 미토 콘 드리 아 칼슘 농도에 국한 되지 않는 다양 한을 사용 하 여 평가 될 수 있다. 그러나, 이러한 분석 미토 콘 드 리아 기능의 단일 스냅숏으로 제공 하 고 따라서 미토 콘 드리 아 건강에 대 한 포괄적인 보기를 제공 하지 않을 수 있습니다. ATP 생성 하는 동안 산소 소비 순차적 반응의 무수 한 의존 때문에, 그것은 미토 콘 드리 아 기능의 우수한 지표 역할. 흥미롭게도, 산소 소비 속도 있는 변이 결과로 미토 콘 드 리아 기능 장애3,,45관찰 되었습니다.
생활 샘플의 산소 소비 속도 (OCR) 기술을 광범위 하 게 두 그룹으로 분할 될 수 있다 사용 하 여 측정 될 수 있다: amperometric 산소 센서와 포 르 피 린 기반 형광체 산소6침묵 될 수 있습니다. Amperometric 산소 센서 측정 OCR 배양된 세포, 조직, 그리고 모델 시스템, C. 선 충등을 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그러나, respirometers를 포함 하는 포 르 피 린 기반 형광체 다음과 같은 이점을: (1) 그들은 허용 3 중, 2 개의 샘플을 나란히 비교 (2) 그들은 작은 샘플 크기를 요구 (예를 들어, 잘 ~ 2, 000−5, 대 당 20 벌레 000 벌레는 상공 회의소)7, 그리고 (3)는 respirometer에서 4 개의 다른 복합 주사 할 프로그래밍 될 수 있다 수동 응용 프로그램에 대 한 필요성을 제거 실험 실행에 걸쳐 시간을 원하는.
이 프로토콜에는 포 르 피 린 기반 산소 감지 respirometer 라이브, 그대로 C. 선 충 에서 측정 OCR 사용 하 여 관련 된 단계는 설명된. 그러나 거기에 대형, 높은 처리량 respirometer8의 사용에 대 한 서 면된 프로토콜이이 프로토콜을 더 많은 예산 친절 하 고, 작은 규모 장비 사용에 대 한 적응 되었습니다. 이 프로토콜은 특히 OCR 두 긴장, 높은 처리량 검사는 필요 하지 않습니다와 그것의 사용은 과도 한 것 간의 차이 평가 하기 위한 유용 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미토 콘 드리 아 호흡은 통찰력 있는 미토 콘 드 리아 기능; 따라서, 생체 외에서 또는 vivo에서 생물 학적 시스템에 산소 소비 속도 측정할 수 있는 매우 귀중 한입니다. Respirometers 산소 또는 산소 압력 전기 전류 비례의 생성에 의존 하는 amperometric 산소 센서를 통해 침묵 얻을 포 르 피 린 기반 형광체를 사용 하 여 산소 레벨을 감지 한다. 클라크 전극 후자의 범주에 폭포와 C. 선 충에 호흡을 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 그의 실험실에서 해 마 XFp를 설정에 대 한 박사 케빈 Bittman 인정 하 고 싶습니다. 국립 보건원 부여 GM088213이이 작업을 지원 합니다.
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
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