Medição das taxas de consumo de oxigênio em intacta Caenorhabditis elegans
Summary
Respiração mitocondrial é fundamental para a sobrevivência; Portanto, a taxa de consumo de oxigênio é um excelente indicador de saúde mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos a utilização de um respirometer comercialmente disponível para medir basal e taxas de consumo máximo de oxigênio em viver, intacto e livremente motile Caenorhabditis elegans.
Abstract
Função mitocondrial ideal é fundamental para a atividade celular saudável, particularmente nas células que têm demandas de alta energia como os do sistema nervoso e muscular. Consistente com isso, a disfunção mitocondrial tem sido associada com uma miríade de doenças neurodegenerativas e envelhecimento em geral. Caenorhabditis elegans tem sido um modelo poderoso sistema para elucidar os muitos meandros da função mitocondrial. Respiração mitocondrial é um forte indicador de função mitocondrial e respirometers recentemente desenvolvidos para oferecer uma plataforma de estado-da-arte para medir a respiração nas células. Neste protocolo, nós fornecemos uma técnica para analisar ao vivo, intacto c. elegans. Este protocolo abrange um período de ~ 7 dias e inclui etapas para o cultivo e a sincronização de c. elegans, (2) preparação de compostos para ser injetado e hidratação das sondas, carregamento e cartucho equilíbrio de drogas (3), (4) preparação do ensaio de minhoca (1) placa e ensaio executado e análise de dados de pós-experiência (5).
Introduction
Trifosfato de adenosina (ATP), a principal fonte de energia celular, é produzido na mitocôndria por enzimas da cadeia de transporte de elétrons (ETC), localizadas na membrana mitocondrial interna. Piruvato, um metabólito chave utilizado para a produção de ATP mitocondrial, é importado para a matriz mitocondrial, onde é sintetizado para produzir Acetil Coenzima A (CoA). Posteriormente, o acetil-CoA entra no ciclo do ácido cítrico, resultando na geração de dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH), uma molécula transportadora de elétrons chave. Como os elétrons do NADH são passados ao oxigênio via o ETC, prótons se acumular no espaço intermembranar mitocondrial, que resulta na geração de um gradiente electroquímico através da membrana. Estes prótons então fluirá do espaço intermembranar este gradiente electroquímico volta para a matriz mitocondrial através do poro de prótons da ATP sintase, dirigindo a sua rotação e a síntese de ATP1 (Figura 1).
Função mitocondrial não está limitada a produção de energia, mas também é crucial para a homeostase do cálcio, espécies reativas de oxigênio (ROS) eliminação e apoptose, criticamente, posicionando sua função na saúde dos2. Função mitocondrial pode ser avaliada usando uma variedade de ensaios, incluindo mas não se limitando a análises que medem o potencial de membrana mitocondrial, os níveis de ATP e ROS e as concentrações de cálcio mitocondrial. No entanto, estes ensaios fornecem um único instantâneo da função mitocondrial e, portanto, não podem fornecer uma visão abrangente da saúde mitocondrial. Desde que o consumo de oxigênio durante a geração de ATP é dependente de uma miríade de reações sequenciais, serve como um indicador superior da função mitocondrial. Curiosamente, foram observadas variações nas taxas de consumo de oxigênio em consequência de disfunção mitocondrial3,4,5.
Taxas de consumo de oxigênio (OCR) de amostras de vida podem ser medidas usando técnicas que podem ser divididas em dois grupos: amperométrico sensores de oxigênio e fósforos porfirina base que podem ser saciados por oxigênio6. Sensores de oxigênio amperométrico têm sido amplamente utilizados para medida de OCR em culturas de células, tecidos e em sistemas modelo, tais como c. elegans. No entanto, fósforos baseados em porfirina contendo respirometers possuem as seguintes vantagens: (1) que permitem uma comparação lado a lado de duas amostras em triplicata, (2) eles exigem menor tamanho de amostra (por exemplo, 20 vermes por alvéolo contra ~ 2, 000−5, 000 vermes na Câmara)7e (3) o respirometer pode ser programado para fazer quatro injeções de diferentes compostas no desejado vezes por todo o experimental, eliminando a necessidade de aplicação manual.
Neste protocolo, passos envolvidos na utilização de uma porfirina base respirometer sensor de oxigênio à medida OCR em ao vivo, intacto c. elegans são descritos. Enquanto houver um protocolo escrito para a utilização do formato grande, alto throughput respirometer8, este protocolo foi adaptado para uso com um instrumento de escala amigável, acessível e menor orçamento mais. Este protocolo é particularmente útil para avaliar a diferença entre duas tensões, onde a seleção da elevado-produção não é necessária e seu uso seria excessivo OCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Respiração mitocondrial é um indicador perspicaz da função mitocondrial; Portanto, ser capaz de medir as taxas de consumo de oxigênio em um sistema biológico, se in vitro ou in vivo é altamente valioso. Respirometers sentir os níveis de oxigénio usando fósforos baseados em porfirina que ficar saciados pelo oxigênio ou através de sensores de oxigênio amperométrico que contam com a geração de um elétrico atual proporcional à pressão de oxigênio. Eletrodo de Clark cai na última categoria e tem sido amp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de reconhecer o Dr. Kevin Bittman para sua orientação no estabelecimento XFp o cavalo-marinho em laboratório. Institutos nacionais de saúde conceder que este trabalho apoiado por GM088213.
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
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