Митохондриальное дыхание имеет решающее значение для выживания Организменное; Таким образом норма потребления кислорода является отличным показателем митохондриального здоровья. В этом протоколе мы описывают использование коммерчески доступных респирометра измерить базальную и максимальной кислорода расхода в жить, нетронутыми и свободно подвижные Caenorhabditis elegans.
Оптимальные функции митохондрий имеет решающее значение для здорового клеточную активность, особенно в клетках, которые имеют высокие энергетические потребности как в нервной системы и мышц. В соответствии с этим, митохондриальной дисфункции был связан с множеством нейродегенеративных заболеваний и старения в целом. Caenorhabditis elegans были мощной модели системы для выяснения многих тонкостях митохондриальной функции. Митохондриальное дыхание является сильным показателем митохондриальной функции и недавно разработанных respirometers предлагают состояние искусства платформу для измерения дыхания в клетках. В этом протоколе мы предоставляем технику для анализа живой, нетронутыми C. elegans. Этот протокол охватывает период ~ 7 дней и включает в себя шаги для синхронизации C. elegans, (2) подготовка соединений для инъекций и гидратации зонды, уравновешивания загрузки и картридж (3) наркотиков, (4) подготовка анализа червя и выращивания (1) пластины и пробирного запуска и анализ данных (5) после эксперимента.
Аденозинтрифосфат (АТФ), основным источником клеточной энергии, производится в митохондриях ферментами в электрон-транспортной цепи (и т.д.), расположенный в внутренней митохондриальной мембраны. Пируват, метаболита ключа используется для митохондриального производства АТФ, импортируется в митохондриальной матрицы, где это декарбоксилировали производить ацетил коэнзима A (CoA). Впоследствии ацетил CoA вводит цикл лимонной кислоты, в результате чего образуются Никотинамидадениндинуклеотид (NADH), ключевых электронов молекулы перевозчик. Поскольку электроны от NADH передаются кислорода через и т.д., протонов накапливаться в митохондриальной межмембранное пространства, что приводит к генерации электрохимических градиента через мембрану. Эти протоны затем будет вытекать из межмембранное пространства через этот электрохимических градиент обратно в матрице митохондриальной через поры Протон АТФ-синтазы, вождение его вращения и синтез АТФ1 (рис. 1).
Митохондриальной функции не ограничивается производства энергии, но также имеет решающее значение для гомеостаза кальция, реактивнооксигенных видов (ров) очистки и апоптоз, критически позиционирование их функции в научные здоровья2. Митохондриальной функции может быть оценена с помощью различных анализов, включая но не ограничиваясь анализов, которые измеряют митохондриальной мембранного потенциала, СПС и ROS уровней и митохондриальной кальция концентрации. Однако эти анализы предоставляют один снимок митохондриальной функции и поэтому не может обеспечить всеобъемлющее представление о митохондриального здоровья. Поскольку потребление кислорода во время генерации АТФ зависит от множества последовательных реакций, он служит превосходной индикатор функции митохондрий. Интересно, что результате митохондриальной дисфункции3,,45наблюдались различия в уровнях потребления кислорода.
Нормы потребления кислорода (OCR) живых образцов может быть измерена с помощью методов, которые можно разделить на две группы: Амперометрическое датчики кислорода и на основе порфирина светомассами, которые могут быть закаленных кислорода6. Датчики растворенного в воде кислорода широко использовались для измерения OCR в культивируемых клеток, тканей и в модели систем, таких как C. elegans. Однако, на основе порфирина Люминофоры, содержащие respirometers обладают следующими преимуществами: (1) они позволяют для бок о бок сравнение двух образцов в трех экземплярах, (2) они требуют меньше размер выборки (например, 20 червей за хорошо против ~ 2, 000−5, 000 червей в Палата)7и (3), которые респирометра может быть запрограммирован делать четыре различных составных инъекции на желаемый раз на протяжении выполнения экспериментальной, устраняя необходимость ручного нанесения.
В этом протоколе шаги с помощью порфирина кислорода зондирования респирометра меру OCR в C. elegans живой, нетронутыми, описанные. Хотя есть письменный протокол для использования большого формата, высокая пропускная способность респирометра8, этот протокол был адаптирован для использования с инструментом более дружественные, доступными и меньшего масштаба бюджета. Этот протокол является особенно полезной для оценки разницы в OCR между двух штаммов, где не требуется высокопроизводительного скрининга и его использование будет чрезмерным.
Митохондриальное дыхание является показателем глубокий митохондриальной функции; Поэтому будучи в состоянии измерить уровень потребления кислорода в биологической системе, будь то в лабораторных условиях или в естественных условиях весьма ценным. Respirometers смысле кислорода с помощью …
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы признать за его руководство в создании Seahorse XFp в лаборатории д-р Кевин Bittman. Национальные институты здравоохранения грант, что GM088213 поддерживает эту работу.
100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
Bleach | Generic | ||
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
Deionized water (dH2O) | |||
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |