Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü
Summary
Mitokondrial solunum organizmalar hayatta kalmak için önemlidir; Bu nedenle, oksijen tüketim oranını mitokondrial sağlık mükemmel bir göstergesidir. Bu iletişim kuralı, Bazal ölçmek için piyasada bulunan bir respirometer nasıl kullanılacağını açıklar ve maksimal oksijen tüketimi oranlarında yaşa, sağlam ve serbestçe hareketli Caenorhabditis elegans.
Abstract
En iyi mitokondriyal işlev özellikle yüksek enerji talepleri de sinir sistemi ve kas gibi olan hücrelerde sağlıklı hücresel hareketlilik için önemlidir. Tutarlı, mitokondrial disfonksiyon sayısız nörodejeneratif hastalıklar ve genel olarak yaşlanma ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Caenorhabditis elegans mitokondriyal işlev birçok inceliklerini elucidating için bir güçlü modeli sistemi olmuştur. Mitokondrial solunum mitokondriyal işlev, güçlü bir göstergedir ve son zamanlarda geliştirilen respirometers solunum hücrelerdeki ölçmek için bir state-of–art platformu sunuyoruz. Bu protokol için biz canlı, bozulmamış C. elegansanaliz etmek için bir yöntem sağlar. Bu iletişim kuralı, ~ 7 gün yayılan ve (1) büyüyen ve senkronizasyon C. elegans, (2) hazırlık bileşikleri enjekte edilir ve hidrasyon probları, (3) uyuşturucu yükleme ve kartuş denge, (4) solucan tahlil hazırlanması için adımları içerir plaka ve tahlil çalıştırmak ve (5) sonrası deneme veri analizi.
Introduction
Adenozin trifosfat (ATP), ana kaynağı hücresel enerjinin mitokondri içinde iç mitokondrial membran bulunan enzimler elektron taşıma zinciri (vb) tarafından üretilmektedir. Pyruvate, mitokondriyal ATP üretimi için kullanılan bir anahtar metaboliti Dekarboksile asetil koenzim A (CoA) üretmek için nerede mitokondrial matris alınır. Daha sonra asetil CoA, sitrik asit döngüsü Nikotinamid adenin dinükleotit (NADH), bir anahtar elektron taşıyıcı molekül üretimi kaynaklanan girer. NADH elektron oksijen vb geçerken proton mitokondriyal intermembrane alanı olan bir elektrokimyasal gradyan üretimi membran arasında sonuçlar kurmak. Bu proton sonra intermembrane uzaydan bu elektrokimyasal degrade boyunca sürüş onun rotasyon ve ATP1 (şekil 1) sentezi ATP sentaz proton gözenek aracılığıyla mitokondrial matris içine geri akacaktır.
Mitokondriyal işlev enerji üretimi için sınırlı değildir ama aynı zamanda kalsiyum Homeostazı, Reaktif oksijen türleri (ROS) atma ve apoptosis, eleştirel onların işlevi organizmalar sağlık2‘ konumlandırma için çok önemlidir. Mitokondriyal işlev dahil ancak bunlarla sınırlı mitokondri zar potansiyel ölçmek analizleri, ATP ve ROS düzeyleri ve mitokondrial kalsiyum konsantrasyonları değil deneyleri, çeşitli kullanılarak değerlendirilebilir. Ancak, bu deneyleri mitokondriyal işlev tek bir görüntüsünü sağlar ve bu nedenle mitokondrial sağlık kapsamlı bir görünümünü sağlamayabilir. ATP üretimi sırasında oksijen tüketimi sıralı reaksiyonlar çok sayıda bağımlı olduğundan, mitokondriyal işlev üstün bir göstergesi olarak hizmet vermektedir. İlginçtir, oksijen tüketim oranları değişimler sonucunda mitokondrial disfonksiyon3,4,5gözlemledim.
Oksijen tüketim oranları (OCR) yaşayan örnekleri ölçülen genel olarak iki gruba ayrılabilir teknikleri kullanarak: amperometric oksijen sensörler ve oksijen6tarafından giderdikten porfirin tabanlı fosforun. Amperometric oksijen sensörler kapsamlı bir şekilde ölçmek OCR kültürlü hücreler, dokular ve C. elegansgibi modeli sistemlerinde kullanılmaktadır. Ancak, porfirin tabanlı fosforun respirometers içeren aşağıdaki avantajlara sahip: (1) onlar izin için bir yan yana karşılaştırma iki nüsha, örnekleri (2) onlar daha küçük örnek boyutu gerektirir (örneğin, 000 ~ 2, 000−5, karşı iyi başına 20 solucan solucanlar odası)7ve (3) respirometer adlı dört farklı bileşik enjeksiyon yapmak için programlanmış kez el ile uygulama ihtiyacını ortadan kaldırarak deneysel çalışma boyunca istenilen.
Bu protokol için bir porfirin tabanlı oksijen algılamalı respirometer ölçüde canlı, bozulmamış C. elegans OCR için kullanmakla ilgili adımlardır açıklanan. Geniş format, yüksek işlem hacmi respirometer8, kullanımı için yazılı bir protokol ise bu iletişim kuralı bir daha fazla bütçe dostu, erişilebilir ve daha küçük ölçekli aleti ile kullanmak için adapte edilmiştir. Bu iletişim kuralı OCR nerede yüksek üretilen iş tarama gerekli değildir ve kullanımı aşırı olurdu iki suşlar arasındaki farkı değerlendirmek için özellikle yararlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondrial solunum mitokondriyal işlev anlayışlı bir göstergesidir; Bu nedenle, tüp bebek veya içinde vivo biyolojik bir sistemde, oksijen tüketim oranları ölçmek için güçlü olmak son derece değerlidir. Respirometers oksijen ya da oksijen basıncı için elektrikli bir geçerli orantılı nesil itimat amperometric oksijen sensörler yoluyla su porfirin tabanlı fosforun kullanarak oksijen düzeyleri hissediyorum. Clark elektrot ikinci kategoriye giriyor ve özellikle solunum C. elegansiçinde a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar laboratuarda Seahorse XFp kurulmasında onun rehberlik için Dr. Kevin Bittman kabul etmek istiyorum. Ulusal Sağlık Enstitüleri GM088213 Bu eser desteklenen verin.
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
- Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
- Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
- Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
- Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents–carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer’s disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. 생화학. 51, 2959-2973 (2012).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. 유전학. 201, 1453-1466 (2015).
