यहाँ हम एक ही जीवित जानवर के भीतर और आक्रामक शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप (उदाहरण के लिए, बायोप्सी) से पहले और बाद में मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं के उच्च संकल्प समय चूक multiphoton इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन. इस विधि ट्यूमर कोशिकाओं ‘प्रवासी, आक्रामक, और एक एकल सेल स्तर पर proliferative व्यवहार पर इन इनवेसिव शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है.
बायोप्सी कैंसर के इलाज के लिए देखभाल के मानक हैं और चिकित्सकीय रूप से फायदेमंद होते हैं क्योंकि वे ठोस ट्यूमर निदान, पूर्वानुमान, और व्यक्तिगत उपचार निर्धारण की अनुमति देते हैं। हालांकि, बायोप्सी और अन्य इनवेसिव प्रक्रियाओं द्वारा ट्यूमर वास्तुकला के क्षोभ ट्यूमर प्रगति पर अवांछित प्रभाव के साथ जुड़ा हुआ है, जो आगे इन प्रक्रियाओं के नैदानिक लाभ में सुधार करने के लिए गहराई से अध्ययन किया जा करने की आवश्यकता है। पारंपरिक स्थिर दृष्टिकोण, जो केवल ट्यूमर का एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं, उनके प्रवास के रूप में ट्यूमर सेल व्यवहार पर बायोप्सी के प्रभाव को प्रकट करने की क्षमता में सीमित हैं, एक प्रक्रिया बारीकी से ट्यूमर द्रोह से संबंधित. विशेष रूप से, ट्यूमर सेल प्रवास अत्यधिक आक्रामक मस्तिष्क ट्यूमर, जहां स्थानीय ट्यूमर प्रसार कुल ट्यूमर लकीर लगभग असंभव बनाता है में महत्वपूर्ण है. multiphoton इमेजिंग और पुरानी इमेजिंग खिड़कियों के विकास वैज्ञानिकों समय के साथ जीवित जानवरों में इस गतिशील प्रक्रिया का अध्ययन करने की अनुमति देता है. यहाँ, हम पहले और एक ही जीवित जानवर में एक बायोप्सी के बाद मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं के उच्च संकल्प अनुदैर्घ्य इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन. यह दृष्टिकोण ट्यूमर सेल व्यवहार (प्रवास, आक्रमण, और प्रसार) पर इस प्रक्रिया के प्रभाव का अध्ययन करना संभव बनाता है। इसके अलावा, हम लाभ और इस तकनीक की सीमाओं पर चर्चा, साथ ही इस पद्धति की क्षमता ट्यूमर लकीर या कीमोथेरेपी के प्रत्यारोपण सहित अन्य शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप के लिए कैंसर सेल व्यवहार में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए Wafers.
सबसे ठोस ट्यूमर के लिए देखभाल के मानक निदान के लिए ऊतक बायोप्सी शामिल, रोग का निदान, और व्यक्तिगत उपचार निर्धारण1,2. कुल मिलाकर, इन प्रक्रियाओं नैदानिक लाभ दे, लेकिन हाल ही में सबूत इंगित करता है कि बायोप्सी और अन्य अधिक इनवेसिव प्रक्रियाओं, ट्यूमर लकीर के रूप में, भी नकारात्मक ट्यूमर प्रगति को प्रभावित कर सकते हैं3,4,5 , 6.हालांकि इन प्रक्रियाओं में रोगी देखभाल अपरिहार्य रहते हैं और उनके लाभ उनके नकारात्मक प्रभाव को दूर, यह पूरी तरह से इन नकारात्मक प्रभाव के पीछे तंत्र को समझने के क्रम में रोगियों की सुरक्षा को अधिकतम करने के लिए आवश्यक है और इन प्रक्रियाओं के सकारात्मक प्रभाव और उन्हें और भी अधिक चिकित्सकीय फायदेमंद बनाते हैं.
ट्यूमर प्रगति पर बायोप्सी-मध्यस्थ अवांछित प्रभाव ऊतक विघटन4,5के जवाब में प्रणालीगत परिवर्तन और ट्यूमर microenvironment में परिवर्तन से ट्रिगर कर रहे हैं। इस प्रकार, यह जीवित पशुओं में इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है। हालांकि, इन न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रियाओं के सूक्ष्म परिणाम अक्सर व्यक्तियों के बीच बड़े बदलाव से प्रच्छन्न किया जा सकता है. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या ट्रांसक्रिप्शनल एक्सप्रेशन विश्लेषण पर आधारित पारंपरिक तरीके इन प्रभावों को अनदेखा कर सकते हैं या उनकी पहचान करने के लिए बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, इन स्थिर दृष्टिकोण ऐसे प्रवास और आक्रमण के रूप में ट्यूमर सेल व्यवहार में परिवर्तन की पहचान करने की क्षमता की कमी, गतिशील प्रक्रियाओं है कि ट्यूमर द्रोह के साथ सहसंबंधित. इन ट्यूमर सेल सुविधाओं अत्यधिक आक्रामक मस्तिष्क ट्यूमर के लिए विशेष महत्व के हैं, ग्लियोब्लास्टोमा multiforme (GBM) के रूप में, जहां ट्यूमर कोशिकाओं के स्थानीय प्रसार शल्य लकीर को सीमित करता है और रोगी अस्तित्व7कम हो जाती है. पूरी तरह से समझने के लिए कैसे बायोप्सी जीबीएम कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित, एक अनुदैर्घ्य दृष्टिकोण है कि जीवित जीवों के शारीरिक संदर्भ में इन कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देता है की जरूरत है.
शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपित पुरानी इमेजिंग खिड़कियों के साथ संयोजन में उच्च संकल्प intravital इमेजिंग के हाल के विकास वैज्ञानिकों कई दिनों से अधिक जीवित चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं के गतिशील व्यवहार का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है8,9. इस शक्तिशाली दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम अध्ययन कर सकते हैं कैसे ट्यूमर कोशिकाओं के proliferative, प्रवासी, और घुसपैठ िया व्यवहार एक ही माउस में एक बायोप्सी के जवाब में कई दिनों से अधिक परिवर्तन. अन्य तकनीकों की तुलना में जो लाइव चूहों में ट्यूमर की बहु-दिन की निगरानी की अनुमति देते हैं, जैसे चुंबकीयअनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)10, पॉजिट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी/ दृष्टिकोण विशिष्ट एकल सेल स्तर पर ट्यूमर सेल व्यवहार का अध्ययन और सूक्ष्म ट्यूमर के भीतर होने वाले परिवर्तनों को जानने की संभावना प्रदान करता है.
यहां, हम ट्यूमर असर चूहों के मस्तिष्क में बायोप्सी की तरह चोट और पूर्व और पोस्टबायोप्सी अनुदैर्घ्य इंट्राविटल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं। इस विधि संभवतः इस तरह के आंशिक ट्यूमर लकीर या कीमोथेरेपी वेफर्स के प्रत्यारोपण के रूप में अन्य शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप, अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
यहाँ हम आक्रामक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के जवाब में एकल सेल स्तर पर ट्यूमर सेल व्यवहार में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन, इस तरह के एक बायोप्सी के रूप में, एक जीवित जानवर के मस्तिष्क में. एक पुरानी CIW के सर्जिकल प्रत्यारोपण के साथ अनुदैर्घ्य multiphoton इमेजिंग के संयोजन से पहले और एक ही जानवर4में बायोप्सी के बाद ट्यूमर सेल प्रवास, आक्रमण, और प्रसार के परिमाणीकरण सक्षम बनाता है। ट्यूमर बहुदिन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया अन्य दृष्टिकोण की तुलना में, जैसेbioluminescent इमेजिंग12, एमआरआई10, या पीईटी / अंतर्निहित ट्यूमर प्रगति.
सफलतापूर्वक इस विधि को करने के लिए, कई कार्यविधियों में महारत हासिल की जानी चाहिए। इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम CIW प्रत्यारोपण और प्रतिस्थापन कर रहे हैं. इन चरणों की तकनीकी जटिलता सटीक और शल्य कौशल है कि स्थिर प्रशिक्षण के साथ प्राप्त किया जा सकता है की आवश्यकता है. CIW सर्जरी के दौरान जटिलताओं, इस तरह के खून बह रहा है जो मस्तिष्क की सतह को कवर कर सकते हैं के रूप में, बाद इमेजिंग के लिए चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है. बाँझ उपकरण या पर्यावरण की कमी है, साथ ही पूरी तरह से मस्तिष्क की सतह सील करने के लिए विफलता, मस्तिष्क की सतह पर एक संक्रमण का कारण बन सकता है (कवरस्लिप के तहत सफेद तरल), जो इमेजिंग समस्याग्रस्त और दृढ़ता से जिसके परिणामस्वरूप समझौता कर देगा व्याख्या. इस प्रोटोकॉल का एक अन्य आम मुद्दा समय चूक इमेजिंग के दौरान पशु आंदोलन है. जबकि किसी भी xyz बदलाव प्रयोग के बाद सही किया जा सकता है, यह जानकारी के किसी भी नुकसान को रोकने के लिए प्रत्येक समय बिंदु से पहले प्रत्येक स्थिति के निर्देशांक को सही करने के लिए सिफारिश की है. ऊतक विरूपण एक अतिरिक्त समस्या है जो एक उल्टे सूक्ष्मदर्शी पर इमेजिंग करते समय पाई जाती है। जब माउस को सुपाच्य स्थिति में रखा जाता है तो मस्तिष्क ऊतक संपीड़न से ग्रस्त होता है। ऊतक विरूपण की डिग्री पर निर्भर करता है, ट्यूमर सेल ट्रैकिंग सेल विस्थापन की एक गलत परिमाणीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसे रोकने के लिए, कठोर और लोचदार विरूपण के लिए एक सॉफ्टवेयर14इस्तेमाल किया जा सकता है.
हालांकि इस प्रक्रिया ट्यूमर व्यवहार में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक आवेदन प्रदान करता है, कुछ सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए. इस विधि वैज्ञानिकों की गहराई तक छवि करने के लिए अनुमति देता है 1.6 मिमी (एक ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला के उपयोग के साथ); हालांकि, इसका मतलब यह है कि इमेजिंग सतही मस्तिष्क प्रांतस्था क्षेत्रों15तक ही सीमित है. इस प्रकार, कुछ मस्तिष्क ट्यूमर गहरी मस्तिष्क संरचनाओं में स्थित, brainstem क्षेत्र में स्थित फैलाना आंतरिक pontine gliomas सहित, इस प्रोटोकॉल के साथ अपने मूल मस्तिष्क वातावरण में अध्ययन नहीं किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल का एक और सीमा ट्यूमर है कि छवि की जा सकती है की मात्रा है. हालांकि कुल ट्यूमर मात्रा स्कैनिंग अधिक से अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए वांछित है, अक्सर, ट्यूमर आकार और प्रवासी कोशिकाओं की गति कारकों को सीमित किया जा सकता है. प्रत्येक ट्यूमर प्रकार के लिए, इमेजिंग के लिए एक इष्टतम समय चूक पर विचार किया जाना चाहिए। यदि छवियों के बीच समय सीमा बहुत लंबी है, यह ट्यूमर कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए मुश्किल हो सकता है. एक गुंजयमान स्कैनर का उपयोग अत्यधिक स्कैनिंग समय कम कर सकते हैं, एक बड़ा ट्यूमर16की इमेजिंग की अनुमति. अंत में, इस प्रोटोकॉल के मैनुअल छवि विश्लेषण बहुत समय लेने वाली हो सकता है, तो बजाय, स्वचालित 3 डी ट्रैकिंग के लिए कार्यक्रमों का इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, ट्रैकिंग के परिणाम हमेशा नेत्रहीन निगरानी की जानी चाहिए क्योंकि स्वचालित सेल ट्रैकिंग के लिए एल्गोरिदम शायद ही कभी ब्याज की कोशिकाओं के बिल्कुल प्रवास recapitulate करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के थोड़ा अनुकूलन अनुप्रयोगों की एक भी व्यापक रेंज सक्षम कर सकते हैं. बायोप्सी प्रदर्शन करने के बजाय, अन्य (सर्जिकल) हस्तक्षेप लागू किया जा सकता है, जैसे आंशिक ट्यूमर लकीर या कीमोथेरेपी वेफर्स की डिलीवरी। एक शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपित microtube के माध्यम से यौगिकों के अलावा इस प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा जा सकता है औषधीय रूप से ब्याज की विशिष्ट अणुओं को लक्षित. हमें उम्मीद है कि इस मॉडल ट्यूमर सेल व्यवहार पर एक निश्चित हस्तक्षेप के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए लक्ष्य अध्ययन में उपयोगी हो जाएगा. एक ही जानवर में दोहराया उपायों के प्रदर्शन की संभावना न केवल ट्यूमर में होने वाले परिवर्तन पर अधिक सटीक डेटा प्रदान करता है, लेकिन यह भी बहुत अध्ययन के प्रति आवश्यक प्रयोगात्मक जानवरों की संख्या कम कर देता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों उनके इमेजिंग समर्थन और एलेन Wehrens और हन्ना जॉनसन proofreading और पांडुलिपि संपादन के लिए Anko de Graaff और Hubrecht इमेजिंग केंद्र धन्यवाद.
25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
Surgical stereo microscope | Olympus | ||
Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |