Summary
نقدم هنا بروتوكولا لعزل "الخلايا الجذعية لب الأسنان" البشرية والدعوة من أجل تقييم التعبير بريون البروتين أثناء عملية تمايز الخلايا العصبية.
Abstract
قضايا الأخلاقيات البيولوجية المتصلة بالتلاعب بالخلايا الجذعية الجنينية أعاقت التقدم في مجال البحوث الطبية. ولهذا السبب، من المهم جداً للحصول على الخلايا الجذعية البالغة من أنسجة مختلفة مثل الدهنية والحبل السري والنخاع العظمى والدم. بين المصادر الممكنة، لب الأسنان تتسم بأهمية خاصة لأنه من السهل الحصول عليها فيما يتعلق باعتبارات أخلاقيات علم الأحياء. والواقع أن الخلايا الجذعية لب الأسنان البشرية (هدبسكس) هي نوع من الخلايا الجذعية البالغة قادرة على التمييز في الخلايا العصبية مثل ويمكن الحصول عليها من المولى الثالث للمرضى الأصحاء (الفئة العمرية 13-19). على وجه الخصوص، لب الأسنان تم إزالتها مع حفارة مقطعة شرائح صغيرة وتعامل مع كولاجيناز الرابع ومثقف في قارورة. للحث على التفريق بين الخلايا العصبية، قد حفزت هدبسكس مع لو/بفجف لمدة أسبوعين. سابقا، قد أثبتنا أنه أثناء عملية التمايز محتوى الخلوية بريون البروتين (PrPج) في هدبسكس زيادة. وأظهر تحليل سيتوفلوريميتريك تعبير مبكر عن الحزب الثوريج التي ازدادت بعد عملية تمايز الخلايا العصبية. الاجتثاث من الحزب الثوريج قبل siRNA PrP حالت دون تمايز الخلايا العصبية الناجمة عن لو/بفجف. في هذه الورقة، توضح لنا أن علينا تعزيز العزل والفصل و في المختبر أساليب زراعة هدبسكس مع عدة إجراءات سهلة، كانت أكثر كفاءة الخلية استنساخ التوسع على نطاق واسع والتي تم الحصول عليها للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) وقد لوحظ. ونحن أيضا إظهار كيف هدبسكس، التي تم الحصول عليها بطرق مفصلة في البروتوكول، ونموذج تجريبي ممتازة لدراسة عملية تمايز الخلايا العصبية MSCs والعمليات الجزيئية والخلوية اللاحقة.
Introduction
وكانت الخلايا الجذعية الوسيطة معزولة من أنسجة عدة، بما فيها نخاع العظام ودم الحبل السري ولب الأسنان البشرية، والأنسجة الدهنية والدم1،2،3،،من45 , 6-كما أفاد العديد من المؤلفين، هدبسكس إظهار البلاستيك التقيد، مورفولوجيا تنتجها الخلايا الليفية مثل نموذجي. وهذه تمثل عدد سكان العالية غير متجانسة مع الحيوانات المستنسخة مميزة والاختلافات في القدرات التكاثري والتفريق7،8. هدبسكس التعبير عن علامات محددة للخلايا الجذعية الوسيطة (أي CD44، CD90، CD73، CD105، قامت-1)، وهي سلبية لبعض العلامات المكونة للدم (مثل CD14 و CD19) وهي قادرة على التمايز في المختبر مولتيلينيجي9، 10،11.
وقد أظهرت العديد من المؤلفين أن هذه الخلايا غير قادرة على التمييز في الخلايا العصبية مثل استخدام البروتوكولات المختلفة، التي تشمل إضافة ستموت، بفجف، لو في تركيبة مع محدد وسائط الإعلام والملاحق7،12. أيضا، تشارك العديد من البروتينات أثناء عملية تمايز الخلايا العصبية، ومن بين هذه، تظهر عدة ورقات دور ذات الصلة والتعبير كبيرة من بروتين بريون الخلوية (PrPج)، سواء في الخلايا الجذعية الجنينية والبالغة13، 14-يمثل الحزب الثوريج جزيء بليوتروبيك قادرة على أداء وظائف مختلفة داخل الخلايا كالنحاس الأيض، المبرمج، والتشديد على المقاومة للأكسدة15،،من1617 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
لدينا ورقة السابقة23، نحن التحقيق في دور الحزب الثوريج في عملية تمايز الخلايا العصبية هدبسكس. وفي الواقع، هدبسكس إكسبريس بريكوسيوسلي PrPج ، وبعد التفريق بين الخلايا العصبية، كان من الممكن نلاحظ زيادة إضافية. مؤلفين آخرين الافتراض بدور محتمل للحزب الثوريج في عمليات تمييز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية. وفي الواقع، محركات PrPج التفريق بين الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الخلايا العصبية، وأوليجوديندروسيتيس، وأستروسيتيس24. وكان الغرض من هذه الدراسة التأكيد على المنهجية للحصول على الخلايا الجذعية من لب الأسنان وعملية التمايز ودور الحزب الثوريج خلال تمايز الخلايا العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد اقتطعت الأضراس الثالثة المستخدمة في الدراسة من المرضى (13-19 سنة) مع لا تاريخ مسبق لاستهلاك الكحول أو المخدرات، والتدخين جميع وصحة الفم والأسنان المناسبة. اليوم من التفسير، في قسم علوم طب الأسنان والفكين في جامعة روما "سابينزا"، تم الحصول على الموافقة المستنيرة من المرضى أو الآباء والأمهات. تم الحصول على الموافقة المستنيرة على أساس الاعتبارات الأخلاقية وموافقة لجنة الأخلاقيات.
1-الأسنان واستخراج لب الأسنان
-
إعداد الوسيلة المناسبة للحفظ أو النقل.
- إعداد "تعديل النسر" دولبيكو متوسط تركيز منخفض من الجلوكوز (دميم-L) مع لام الجلوتامين (494.5 مل).
- إضافة 5 مل من البنسلين/ستربتوميسين (1%) و 0.5 مل الامفوتريسين (0.1%).
- استخراج المولى الثالث من المريض، بسرعة شطفة مع برنامج تلفزيوني، ووضعت في أنبوب اختبار 15 مل مع المتوسط ونقلها إلى المختبر في أقل من 2 ح.
- تحت غطاء واقية، فتح الأسنان مع قاطع بتمرير قطع الاكليلية المماس سقف قاعة اللب ومتوازية.
- بلطف إزالة اللب مع حفارة صغيرة ووضعها في أنبوب اختبار.
- أغسل ثلاث مرات ببرنامج تلفزيوني والطرد المركزي في س 2,500 ز لمدة 10 دقائق في الرايت
2-معالجة لب الأسنان والإفراج عن الخلايا الجذعية
- إزالة المادة طافية، ريسوسبيند بيليه في الحل في هانك ووضعه في طبق بتري. احتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية في شركة 5%2.
-
اكتب الرابع كولاجيناز إعداد الحل.
- إعداد 0.8 مل من دميم-l.
- تذوب 1 مغ من النوع الرابع كولاجيناز مل 0.8 L دميم ودوامه لمدة عدة دقائق.
- إضافة دميم-L تصل إلى 1 مل أن يكون تركيز نهائي 1 ملغ/مل.
- تصفية الحل مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
- إزالة الحل هانك بواسطة الطرد المركزي في س 2,500 ز لمدة 10 دقائق في الرايت ويقسم اللب إلى شرائح صغيرة أبروكسيماتيفيلي 1 مم كل واحد مع مشرط المتاح.
- وضع شرائح اللب في طبق بتري واحتضان مع 1 مل من النوع الرابع كولاجيناز لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في شركة 5%2.
-
إعداد الثقافة المتوسطة (500 مل).
- إلى 445 مل من دميم-L مع لام الجلوتامين.
- إضافة 50 مل مصل البقري الجنين (FBS) (10%).
- إضافة 5 مل من البنسلين/ستربتوميسين (1%).
- الطرد المركزي العينة في س 2,500 ز لمدة 10 دقائق في الرايت، إزالة المادة طافية، ريسوسبيند بيليه في الأجل المتوسط (الخطوة 2، 5) والثقافة في قارورة T25 محددة للخلايا الجذعية في 37 درجة مئوية في شركة 5%2.
3-الخلايا الجذعية الثقافة والنشر
- كل يوم تحقق الثقافة، وبعد 3 أيام نمو، مراقبة مختلفة استنساخ الخلايا ملتصقة داخل قارورة.
- تغيير كل 3 أيام المتوسطة الثقافة.
- بين 7 و 12 يوما، بمجرد الوصول إلى التقاء الخلايا ملتصقة، فصل لهم بعلاج الخلايا مع 1 مل يدتا التربسين لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية أو برفق باستخدام مكشطة خلية.
- إضافة 4 مل (نسبة 1:5) للثقافة المتوسطة (الخطوة 2.5) لوقف عمل التربسين.
- الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 6 دقائق في 259 x زوإزالة المادة طافية ووضع الخلايا في قارورة T25 للنشر.
ملاحظة: كل 3 أيام تصل الخلايا إلى التقاء. - تنتشر الخلايا تصل إلى 21 أو 28 يوما (حوالي 6-8 فقرات) لتجنب الوجود غير الجذعية مثل الخلايا في الثقافة.
- فصل الخلايا مع 1 مل يدتا التربسين لمدة 3 دقيقة في 37 درجة مئوية أو إلغاء بلطف. الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 6 دقائق في 259 x ز.
- إزالة المادة طافية واختبار الخلايا لتحليل سيتوفلوريميتريك (الخطوة 6).
4-عابر PrPج سيلينسينج ب siRNA
- الثقافة هدبسكسين 6-جيدا لوحات (2 × 105 خلية/مل) مع 2 مل من الثقافة المتوسطة (الخطوة 2.5) ح 24.
-
اليوم التالي، إعداد siRNA PrP المتوسطة (400 ميليلتر).
- إضافة إلى أنبوب اختبار عقيمة، 384 ميليلتر دميم-l.
- إضافة 1 ميليلتر لكل نوع من siRNA الحزب الثوري إلى دميم-L يكون تركيز نهائي من 5 نانومتر (siRNA 4 تستخدم الحزب الثوري والتحقق من قبل المورد لضمان نسبة % إيه سيفن زيرو كفاءة ضربة قاضية).
- إضافة 12 ميليلتر من ترانسفيكتيونريجينت إلى دميم-l.
- دوامة الخليط واحتضان لمدة 10 دقيقة على RT للسماح بتشكيل مجمعات تعداء.
- إضافة 400 ميكروليتر siRNA PrP متوسطة لكل عينة واحتضانها ح 6 عند 37 درجة مئوية.
- دون تجاهل siRNA PrP المتوسطة، إضافة 1.6 مل (نسبة 1 إلى 5) من الثقافة المتوسطة (الخطوة 2، 5).
- ترك الخلايا ح 72 في 37 درجة مئوية.
- إزالة المادة طافية ويغسل 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني في الرايت
- إضافة 2 مل من الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة لمدة 7 أو 14 يوما (الخطوة 5، 1).
- تغيير المتوسطة ثقافة العصبية كل 3 أيام.
ملاحظة: استبدال siRNA حل الحزب الثوري كل وقت استبدال المتوسطة ثقافة العصبية. - في نهاية الوقت، يغسل 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني في الرايت واختبار الخلايا العصبية المستضدات السطحية بتحليل "لطخة الغربية".
5-الخلايا العصبية عملية الاستقراء من هدبسكس
-
إعداد الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة (500 مل).
- إعداد مل 444.7 وسائط القاعدية للخلايا العصبية.
- للمتوسط إضافة 50 مل ملحق خالية من المصل يستخدم لدعم استمرارية على المدى الطويل للخلايا الجذعية العصبية الجنينية والكبار (10%).
- إضافة 200 ميليلتر من أساسية "تنتجها الخلايا الليفية عامل النمو" (بفجف) (تركيز النهائي 40 نانوغرام/ملليلتر) و 100 ميليلتر من عامل نمو البشرة (لو) إلى المتوسطة (التركيز النهائي 20 نانوغرام/ملليلتر).
- إضافة 5 مل من البنسلين/ستربتوميسين (1%) إلى المتوسط.
- هدبسكس الثقافة في لوحات 6-جيدا (2 × 105 خلية/مل) تصل إلى 28 يوما من فصل اللب وتحفيز لهم مع 2 مل من الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة.
- كل 3 أيام تجاهل المادة طافية ويغسل 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني في الرايت واستبدال 2 مل المتوسطة ثقافة العصبية.
- وبعد أيام 7 و/أو 14، فصل الخلايا مع 1 مل يدتا التربسين لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية أو بلطف مكشطة.
- إضافة 4 مل (نسبة 1:5) للثقافة المتوسطة (الخطوة 2.5) لوقف عمل التربسين.
- اختبار وجود المستضدات السطحية العصبية (الخطوة 6) أو تعبير بروتين بريون (الخطوة 7) عن طريق تحليل التدفق الخلوي.
6-وصف هدبسكس "التدفق الخلوي"
- تحديد الوسيطة stromal (MSC)-المستضدات السطحية محددة أو الخلايا العصبية.
- الثقافة هدبسكس في لوحات 6-جيدا (2 × 105 خلية/مل) مع 2 مل من الثقافة المتوسطة (الخطوة 2، 5).
- فصل هدبسكس في 28 يوما من فصل لب الأسنان أو بعد 14 يوما من الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة (الخطوة 5، 1) مع 1 مل يدتا التربسين لمدة 3 دقيقة في 37 درجة مئوية أو مكشطة بلطف.
- إضافة 4 مل (نسبة 1:5) للثقافة المتوسطة (الخطوة 2.5) لوقف عمل التربسين وسينتريفوجاتي في 259 x ز لمدة 6 دقائق في الرايت يغسل آخر مرة 2 مع 2 مل من برنامج تلفزيوني في الرايت
- فيكس هدبسكس غير المعالجة أو المعالجة مع بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- بيرميبيليزي هدبسكس مع الفاعل غير الأيونية 0.1% (v/v) في برنامج تلفزيوني عن 10 دقيقة إضافية في الرايت
- تنفيذ حظر مع الحليب المجفف الخالي 5% في 1 مل من برنامج تلفزيوني عن ح 1 في الرايت
- أغسل 3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا مع مكافحة--CD105 (1: 100/5 × 10 الخلايا5 )، CD44 مكافحة (1: 100/5 × 10 الخلايا5 ) المضادة-قامت-1 (1: 100/5 × 105 خلايا)، مكافحة--CD90 (1: 100/5 × 10 الخلايا5 )، مكافحة--CD73 (1: 100/5 × 105 الخلايا)، مكافحة β3-Tubulin (1: 100/5 × 105 خلايا)، مكافحة--الشركة (1: 100/5 × 105 خلايا) ومكافحة GAP43 (1: 100/5 × 105 خلايا) ماب ح 1 في الرايت
- تغسل الخلايا 3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان مع الماوس المضادة PE (01:50/5 × 105 خلايا) أو CY5 أرنب المضادة الإنسان والمحيط الحيوي (01:50/5 × 105 خلايا) ح 1 إضافية في الرايت
- استخدام الأجسام المضادة الثانوية النابضة الخلايا إيمونوبوسيتيفي (PE الماوس المضادة أو أرنب المضادة CY5 ماب) وتحليل جميع العينات مع سيتوميتير تدفق والحصول على الأحداث على الأقل 20,000.
7-تقييم التعبير PrPج في هدبسكس بتحليل التدفق الخلوي
- الثقافة هدبسكسين 6-جيدا لوحات (2 × 105 خلية/مل) مع 2 مل من الثقافة المتوسطة (الخطوة 2، 5).
- فصل هدبسكس في 21 و 28 يوما من فصل لب الأسنان وبعد أيام 7 و/أو 14 مع الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة (الخطوة 5، 1) مع 1 مل من التربسين-يدتا ووقف عمل التربسين كما هو موضح في الخطوة 6، 4. إصلاح العينات مع بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- بيرميبيليزي مع سورفاكتانتين غير الأيونية 0.1% (v/v) برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في إزالة الرايت المادة طافية ووصمة عار الخلايا مع أرنب PrP مكافحة ماب EP1802Y (01:50/5 × 105 خلايا) ماب ح 1 في الرايت إينكوباتي مع أرنب المضادة CY5 (01:50/5 × 105 خلايا) للإنسان والمحيط الحيوي ل ح 1 إضافية في الرايت
- تحليل جميع العينات مع سيتوميتير تدفق وتكتسب الأحداث 20,000 على الأقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إجراءات العزل والفصل هدبسكس من لب الأسنان، التي تم الحصول عليها من المولى الثالث، هي العمليات المعقدة التي يمكن أن تؤدي التغييرات الصغيرة نتيجة مدمرة. في هذه الورقة، ونحن استخدام البروتوكول لآرثر et al. 12 مع العديد من التحسينات. ويرد في الشكل 1مخطط تمثيلي للإجراءات.
هدبسكس يمثل عدد سكان غير متجانسة من الخلايا مع الحيوانات المستنسخة مميزة والاختلافات في القدرات التكاثري والتفريق7،8. بعد فصل اللب والبذر لأجزاء صغيرة من لب الورق، لاحظنا مجموعات من الخلايا التوسع في المحيط. ويبين الشكل 2 مجموعة صغيرة من الخلايا في يوم واحد (اللوحة اليمنى)، 4 أيام (الفريق المركزي) و 7 أيام (اللوحة اليمنى) من فصل لب الأسنان. وبشكل عام، هذه المجموعات من الخلايا يكبر التوصل إلى الالتقاء بين 7 و 12 يوما تقريبا.
هذه الخلايا، بعد تمايز الخلايا العصبية الناجمة عن لو/بفجف، الحد من نموها، وبعد أسبوعين كان من الممكن لمراقبة تغييرات كبيرة في ثمرة مورفولوجيا ونيوريتيس الخلية (الشكل 3).
نحن في الشكل 4، يظهر أن هدبسكس غير المعالجة من التعبير عن مولتيبوتينت mesenchymal stromal محددة سطح المستضدات مثل5،CD44، CD90، CD105، CD73، وقامت-19. وبخلاف ذلك، بعد المحفزات المناسبة تحريض الخلايا العصبية، هدبسكس التعبير عن علامات العصبية محددة مثل β3-Tubulin، والشركة، و GAP43. هدبسكس، المنبهات غير المعالجة أو المعالجة بتحريض الخلايا العصبية، لا تعبر عن علامات المكونة للدم مثل CD14 و CD19.
في الشكل 5، نظهر أن هدبسكس عن بريكوسيوسلي PrPج (21 و 28 يوما)، وبعد عملية تمايز الخلايا العصبية الناجمة عن لو/بفجف لأيام إضافية في 7 و 14، المحتوى PrPج زيادة (الشكل 5ألف). حيث ذكرت العديد من المؤلفين أن الحزب الثوري الشعبيج متورطة في التفريق بين الخلايا العصبية الخلوية، يمكننا تقييم دور PrP الذاتيةج في هذه العملية. ولذلك، والجيش الملكي النيبالي تدخل صغيرة (siRNA PrP) طبقت يجتذ PrPج ووظيفتها. المعالجة المسبقة مع siRNA ح 72 قبل المحفزات لو/بفجف لمدة 14 يوما يمنع التعبير عن علامات العصبية B3-tubulin والصندوق (الشكل 5ب). وتظهر البيانات أن إسكات PrPج قبل siRNA تتأثر عملية تمايز الخلايا العصبية هدبسكس، فعل لو/بفجف بعد أسبوعين.
الشكل 1 : مخطط لفصل لب الأسنان من المولى الثالث- تم فتح مع قطع الأسنان بتمرير قطع الاكليلية موازية والظل من خلال سقف قاعة اللب واللب بلطف إزالتها تحت ظروف معقمة مع حفارة صغيرة ووضعت في أنبوب اختبار. اللب، وبعد العلاج هانك للحل، مقطعة شرائح وتعامل مع كولاجيناز الرابع لمدة 15 دقيقة ويتم نشرها في قارورة T25. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : هدبسكس مورفولوجيا في أيام مختلفة من فصل لب الأسنان بالمجهر الطوري. مورفولوجية هدبسكس من لب الأسنان في أيام مختلفة (1، 4، 7) من فصل لب الأسنان. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : ثمرة نيوريتي هدبسكس بالمجهر الطوري. مورفولوجية هدبسكس من الأسنان اللب غير المعالجة أو المعالجة مع لو/بفجف لمدة 14 يوما. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : وصف هدبسكس. تحليل التدفق الخلوي CD44، CD90، CD105، CD73، قامت-1، CD14، CD19، β3-Tubulin، التعبير الشركة و GAP43 في هدبسكس غير المعالجة أو المعالجة مع لو/بفجف لمدة 14 يوما. رسوم بيانية تمثل سجل fluorescence مقابل عدد الخلايا، بوابات على السكان خلية من الرسم البياني المبعثر (س/خ) مبعثر/الأمام الجانب. تمت مقارنة كل فريق مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة كعنصر سلبي. تظهر تجربة ممثل بين 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : دور الحزب الثوريج خلال تمايز الخلايا العصبية من هدسبكس- (أ) تحليل سيتوفلوريميتريك التعبير PrPج دون علاج (21 و 28 يوما من فصل لب الأسنان) وبعد أيام 7 و 14 إضافية مع وسائل الإعلام التعريفي العصبية مماثلة/بفجف. تمت مقارنة كل فريق مع عنصر تحكم ايستب السلبية مفتش المقابلة. تظهر تجربة ممثل بين 3. (ب) تحليل لطخة غربية لعلامات العصبية β3-Tubulin والشركة التعبير (28 يوما من فصل لب الأسنان) وبعد 14 يوما إضافية مع وسائل الإعلام التعريفي العصبية مماثلة/بفجف في وجود أو عدم وجود siRNA الحزب الثوري. وقد تم تعديل هذا الرقم 5 (أ، ب) من "دور بريون البروتين-EGFR مجمع مولتيموليكولار خلال تمايز الخلايا العصبية لطب الأسنان المستمدة من اللب الخلايا الجذعية البشرية" 23. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العمل، وركزنا على منهجية للعزل والتفريق بين الخلايا العصبية هدبسكس؛ وعلاوة على ذلك، يمكننا تقييم دور الحزب الثوريج في هذه العملية. هناك عدة طرق لعزل والتفريق بين هدبسكس في الخلايا مثل الخلايا العصبية والخطوات الحاسمة خلال العملية. هدبسكس قادرين على التفريق في الأنساب عدة مثل الخلايا العصبية وخلايا الاوستيوبلاستس، تشوندروبلاستس و adipocytes. ونحن في ورقتنا، التحقيق في آليات التمييز بين الخلايا العصبية ووجود الحزب الثوريج. كما نوقش أعلاه، التعبير عن هذه الخلايا نموذجي mesenchymal stromal محددة المستضدات السطحية مثل CD44، CD90، CD105، CD73، وقامت-110،،من2526.
يمكن أن يسبب العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول، وفشل إجراءات الانفصال. ويمثل اختيار المرضى27الخطوة الحاسمة الأولى. في تجربتنا، وجدنا أن العمر المتزايد من الجهات المانحة (> 20) تدريجيا يقلل من قدرة الانتشار وتمايز الخلايا الجذعية. في تجاربنا، قمنا باستخدام الأضراس الثالثة التي اقتطعت من المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين 13 19 عاماً ومع لا تاريخ مسبق لاستهلاك الكحول أو المخدرات، التدخين جميع وصحة الفم والأسنان المناسبة.
والخطوة الحاسمة الثانية يمثلها اختيار الإنزيم لفصل الخلايا من الأنسجة اللب، التي يمكن أن تمثل خطوة الساخنة الرئيسية لإجراء فصل الخلايا الجذعية. وفي الواقع، لقد أدركنا أن استخدام مجموعة واسعة من كولاجيناز الأول والثاني، الإنزيمات التي يمكن أن تكون عدوانية جداً، يمكن أن يلحق الضرر الخلايا الموجودة في أنسجة اللب أثناء عملية الفصل. لهذا السبب، قررنا استخدام الرابع كولاجيناز نظراً لأن هذا النوع من كولاجيناز كنشاط تريبتيك أقل من كولاجيناز النوع الأول والثاني. بعد بالضبط من هذا الإجراء، فمن الممكن الحصول على الخلايا الجذعية في 90% الأسنان المعالجة.
بعد الفصل، هو مثقف الحل الذي يحتوي على هدبسكس في قوارير المناسبة حتى مرور 6° (أبروكسيماتيفيلي 21-28 يوما) لتجنب الوجود من غير--الخلايا الجذعية في الثقافة. في غضون 28 يوما، أنها كانت اختبار لوجود المستضدات الوسيطة نموذجي (على النحو المشار إليه أعلاه) والمستخدمة للتجارب فقط عندما كانت إيجابية. في الواقع، على الرغم من التقدم المحرز طوال سنوات على هدبسكس، هناك مهمة لا تزال القيود التي يمثلها المدقع عدم تجانس السكان.
كما هو موضح بالعديد من المؤلفين، وهناك أنواع السكان خلية مختلفة في لب الأسنان، وحتى الآن، فقد معروف ما هو تعمل أفضل قادرة على التمييز في كل النسب الوسيطة (تشوندروبلاستس، أديبوبلاستس، وخلايا الاوستيوبلاستس أو الخلايا العصبية). لتجنب القيود المفروضة حاليا على إجراءات لدينا وغيرها، ستكون الخطوة التالية لتحديد السكان الخلوية مع محددة تعمل باستخدام الأجسام المضادة المحددة.
واظهرنا في الأعمال السابقة، أعرب الحزب الثوريج من هدبسكس. وفي الواقع، من الممكن التقيد الإيجابية ضعيفة في 21 يوما، وزيادة المحتوى PrPج 28 يوما. وعلاوة على ذلك، لاحظنا أن خلال لو/بفجف-بوساطة الخلايا العصبية التعريفي، وكذلك زاد محتوى PrPج . وعلاوة على ذلك، نحن التحقيق في دور الحزب الثوري الذاتيةج في عملية تحريض الخلايا العصبية من هدبسكس. تكميم أفواه عابر للحزب الثوريج منع عملية التمايز هدبسكس الناجمة عن بفجف لو/23.
ونحن صقل وتحسين أساليب العزل والفصل وزراعة في المختبر من هدبسكس مع إجراءات بسيطة ومرنة. تسمح هذه الابتكارات الحصول على استنساخ الخلايا أكثر كفاءة والتوسع على نطاق واسع في الخلايا الجذعية الوسيطة. أيضا، فإننا نقترح أن يتم هدبسكس نموذج تجريبي ممتازة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية لعملية تمايز الخلايا العصبية MSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل أيده "مؤسسة بروني" ومحور جامعة رييتي "سابينا الجامعي" إلى ماتي فينتشنزو.
الشكل 5 (أ، ب) طبع بإذن الناشر تايلور وفرانسيس المحدودة من: "دور بريون" البروتين-EGFR مجمع مولتيموليكولار خلال تمايز الخلايا العصبية لطب الأسنان المستمدة من اللب الخلايا الجذعية البشرية. مارتيلوكسي، س.، Manganelli ف، جيم سانتاكروس، واو سانتيلي، لام بيكولي، م. سوريسي، وخامساً ماتيي بريون. 4 مارس عام 2018. تايلور وفرانسيس المحدودة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce |
| Anti-B3tubulin | Cell Signaling Technology | #4466 | One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system |
| Anti-CD105 | BD Biosciences | 611314 | Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail |
| Anti-CD44 | Millipore | CBL154-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-CD73 | Cell Signaling Technology | 13160 | CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides |
| Anti-CD90 | Millipore | CBL415-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-GAP43 | Cell Signaling Technology | #8945 | Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity |
| Anti-mouse PE | Abcam | ab7003 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-NFH | Cell Signaling Technology | #2836 | Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein |
| Anti-PrP mAb EP1802Y | Abcam | ab52604 | Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP |
| Anti-rabbit CY5 | Abcam | ab6564 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-STRO 1 | Millipore | MAB4315-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| B27 Supp XF CTS | Gibco by life technologies | A14867-01 | B-27 can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture |
| BD Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | AC6531180187 | Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm) |
| BD Accuri C6 Software | BD Biosciences | Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results | |
| bFGF | PeproThec, DBA | 100-18B | basic Fibroblast Growth Factor |
| Centrifuge CL30R | Termo fisher Scientific | 11210908 | it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density |
| CO2 Incubator 3541 | Termo fisher Scientific | 317527-185 | it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures |
| Collagenase, type IV | Life Technologies | 17104019 | Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen |
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 501 | It is use to cut tissues |
| DMEM-L | Euroclone | ECM0060L | Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate |
| EGF | PeproThec, DBA | AF-100-15 | Epidermal Growth Factor |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems |
| Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter | Sarstedt | 831,823,101 | it is a device that is used for filtration of solutions |
| Flexitube GeneSolution for PRNP | Qiagen | GS5621 | 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA N.4 CAGTGACTATGAGGACCGTTA |
| Hank's solution 1x | Gibco by life technologies | 240200083 | The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells |
| HiPerFect Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations |
| Neurobasal A | Gibco by life technologies | 10888022 | Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures |
| penicillin/streptomycin | Euroclone | ECB3001D | It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Euroclone | ECB4004LX10 | PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range |
| TC-Platte 6 well, Cell+,F | Sarstedt | 833,920,300 | It is a growth surface for adherent cells |
| Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap | Sarstedt | 833,910,302 | Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions |
| Trypsin-EDTA | Euroclone | ECB3052D | Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface |
| Tube | Sarstedt | 62,554,502 | Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP |
| VBH 36 C2 Compact | Steril | ST-003009000 | Offers totally protection for the enviroment and worker |
| ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope | Zeiss | 3849000962 | ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods. |
References
- Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
- Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
- Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
- Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
- Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561 (2016).
- Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14 (2015).
- Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
- Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
- Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
- Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
- Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
- Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
- Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34 (2017).
- Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
- Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77 (2017).
- Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
- Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
- Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571 (2017).
- Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
- Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
- Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
- Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
- Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
- Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
- Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146 (2012).
