Un metodo di laboratorio per misurare lo sbadiglio contagioso nei ratti

Summary

Il metodo qui descritto mira ad ottenere curve di contagio dello sbadiglio in coppie di ratti maschi familiari o sconosciuti. Le gabbie con fori separati da partizioni chiare o opache con (o senza) fori vengono utilizzate per rilevare se il contagio visivo, olfattivo o entrambi i tipi di segnali sensoriali possono stimolare il contagio dello sbadiglio.

Abstract

La comunicazione è un aspetto essenziale della vita sociale animale. Gli animali possono influenzarsi a vicenda e riunirsi nelle scuole, nelle greggi e nelle mandrie. La comunicazione è anche il modo in cui i sessi interagiscono durante il corteggiamento e come i rivali risolvono le controversie senza combattere. Tuttavia, ci sono alcuni modelli comportamentali per i quali è difficile testare l’esistenza di una funzione di comunicatore, perché sono probabilmente coinvolti diversi tipi di modalità sensoriali. Ad esempio, lo sbadiglio contagioso è un atto di comunicazione nei mammiferi che potenzialmente si verifica attraverso la vista, l’udito, l’olfatto o una combinazione di questi sensi a seconda che gli animali siano familiari tra loro. Pertanto, per testare ipotesi sul possibile ruolo comunicatorio di tali comportamenti, è necessario un metodo adatto per identificare le modalità sensoriali partecipanti.

Il metodo qui proposto mira ad ottenere curve di contagio dello sbadiglio per ratti familiari e sconosciuti e valutare la partecipazione relativa delle modalità sensoriali visive e olfattive. Il metodo utilizza materiali poco costosi, e con alcune piccole modifiche, può essere utilizzato anche con altre specie di roditori come i topi. Nel complesso, il metodo prevede la sostituzione di divisori chiari (con o senza fori) con divisori opachi (con o senza fori) che consentono o impediscono la comunicazione tra ratti posizionati in gabbie adiacenti con fori nei lati adiacenti. Di conseguenza, si possono testare quattro condizioni: comunicazione olfattiva, comunicazione visiva, comunicazione visiva e olfattiva, né comunicazione visiva né olfattiva. Come l’interazione sociale si verifica tra i ratti, queste condizioni di test simulano ciò che può verificarsi in un ambiente naturale. A questo proposito, il metodo qui proposto è più efficace dei metodi tradizionali che si basano su presentazioni video la cui validità biologica può sollevare preoccupazioni. Tuttavia, non discrimina tra il potenziale ruolo dell’udito e i ruoli dell’olfatto e della visione nel contagio dello sbadiglio.

Introduction

Tradizionalmente, il comportamento dei comunicatori è stato studiato da due prospettive. Da un punto di vista, gli etologi osservano e registrano il comportamento degli animali in ambienti naturali e tentano di riconoscere il suo valore adattivo¹. Il senso o i sensi particolari coinvolti non sono stati l’interesse primario di questi studi. Da un’altra prospettiva, i fisiologi sono più interessati a svelare i meccanismi con cui gli animali comunicano¹; quindi, studi di laboratorio hanno fornito metodi per affrontare il ruolo che le modalità sensoriali svolgono nella comunicazione^2,3. Queste due prospettive sono infatti complementari, perché la conoscenza sia del valore adattivo che dei meccanismi immediati è necessaria per ottenere una comprensione completa dei comportamenti comunicativi nella vita sociale degli animali.

Il comportamento dello sbadiglio è una componente cospicua del repertorio comportamentale in diverse specie di vertebrati⁴, che vanno dai pesci ai primati⁵. Può essere descritto come una lenta apertura della bocca e il mantenimento della sua posizione aperta, seguita da una chiusura più rapida della bocca⁵. La durata dell’intera sequenza dipende dalla specie; ad esempio, i primati sbadigliano per durate più lunghe rispetto alle specie non-primati⁶. In molte specie, con gli esseri umani che fanno l’eccezione, i maschi tendono a sbadigliare più frequentemente delle femmine⁷. Questa funzione potrebbe essere alla base della possibile funzione comunicativa dello sbadiglio, anche se i modelli regolari di sbadiglie e la sua frequenza giornaliera possono anche suggerire una funzione fisiologica. Nei ratti, lo sbadiglio spontaneo segue un ritmo circadiano, con picchi di alta frequenza che si verificano al mattino e al pomeriggio^8,9.

Una caratteristica interessante del comportamento sbadiglio è che può essere un atto contagioso (quando lo stimolo di rilascio di un comportamento sembra essere un altro animale che si comporta allo stesso modo¹⁰) in diverse specie di vertebrati^{11,12, 13,14,15,16}, compresi gli uccelli¹⁷ e roditori¹⁸. Inoltre, prove recenti hanno indicato che lo sbadiglio contagioso può riflettere un ruolo comunicativo, perché lo sbadiglio di un ratto può influenzare lo stato fisiologico di un altro quando esposto a spunti olfattivi¹⁹. Tuttavia, se lo sbadiglio ha o meno un ruolo comunicante è ancora in discussione^20,21, e analizzare lo sbadiglio contagioso è un primo passo essenziale per risolvere questo problema.

D’altra parte, lo sbadiglio contagioso è stato collegato alla capacità di un animale di immedesimarsi con le prospettive di altri animali; quindi, gli individui strettamente correlati sono più propensi a mostrare contagio⁴. Questa ipotesi è stata spesso testata in condizioni di laboratorio in cui gli animali sono presentati con stimoli di sbadiglio sul video^12,13; quindi, il contagio può avvenire solo attraverso segnali visivi. Altre indagini hanno valutato il contagio dello sbadiglio in condizioni più naturali utilizzando gruppi di animali^14,15. Uno dei principali problemi di questo è che gli animali socialmente interagenti spesso rispondono a segnali e si scambiano segnali che vengono trasmessi attraverso combinazioni di modalità sensoriali. Disentangling i sensi effettivi coinvolti in un determinato comportamento dai loro effetti combinati non è sempre un compito facile. Tipicamente, i ricercatori farmacologicamente o chirurgicamente ostacolano l’uso di un animale di un determinato senso, quindi deducono il ruolo di quel senso nel comportamento pertinente^2,3,18,22. Fortunatamente, ci sono altri metodi in cui solo le barriere fisiche vengono utilizzate per consentire o ostacolare la comunicazione tra gli animali^23,24,25, ottenendo così una maggiore validità biologica.

Il metodo qui proposto è stato specificamente progettato per studiare lo sbadiglio contagioso in ratti familiari e sconosciuti in un ambiente sociale. Secondo l’ipotesi empatica, il primo gruppo dovrebbe essere più suscettibile allo sbadiglio contagioso. Il metodo non richiede agli animali di essere chirurgicamente o farmacologicamente privati di qualsiasi senso. Invece, funziona posizionando i ratti in gabbie adiacenti con fori e ostruendo fisicamente la loro comunicazione utilizzando divisori chiari o opachi con o senza fori. Pertanto, si possono esaminare quattro condizioni di prova: (1) comunicazione olfattiva (OC, divisore opaco perforato), (2) comunicazione visiva (VC, divisore chiaro non forato), (3) comunicazione visiva e olfattiva (VOC, divisore chiaro perforato) e (4) nessuno dei due comunicazione visiva né olfattiva (NVOC, divisore opaco non forato). Pertanto, i ricercatori possono confrontare i contributi relativi di olfattivo, visivo, e in una certa misura, spunti uditivi in contagio sbadiglio. Questo approccio non è nuovo, in quanto metodi simili sono stati utilizzati per isolare i sensi coinvolti in determinati comportamenti comunicatori in animali come lucertole²³ e topi²⁶. Infatti, Gallup e colleghi²⁷ hanno usato un metodo simile per dimostrare il ruolo dei segnali visivi nello sbadiglio contagioso nei budgerigars. Le caratteristiche principali di questi metodi sono la simulazione di un contesto sociale e lo stress minimo inflitto agli animali. Inoltre, l’uso di animali interagenti aumenta la validità biologica delle conclusioni.

Ci sono diversi modi per misurare lo sbadiglio contagioso^25,28. Dr. Stephen E. G. Lea (comunicazione personale, 2015) ci ha aiutato ad adattare numericamente un metodo precedentemente impiegato dai primatologi^13,14 per una precedente analisi dei dati utilizzati qui¹⁸. Presentato in questo protocollo è una versione migliorata di questo metodo con una più ampia gamma di applicazioni. Consiste nel pesare il numero totale di sbadigli di un ratto, all’interno e all’esterno di una determinata finestra temporale, in base alla proporzione del tempo di osservazione corrispondente agli sbadigli all’interno e all’esterno della finestra temporale.

Ad esempio, se si presume che i ratti A e B siano osservati per 12 min, il loro sbadiglio viene registrato al minuto più vicino e un intervallo di tempo di 3 minuti è impostato per misurare lo sbadiglio contagioso. Successivamente, vengono considerate le seguenti sequenze di sbadigli per ciascuno di questi ratti: ratto A (0,0,0,0,0,2,0,0,0,2,1) e ratto B (0.1,1,0,1,0,0, 0,0,3). Va notato che ogni numero (0-3) corrisponde al numero di sbadigli segnati ad ogni min. Per il ratto A, durante i minuti 1, 10 e 11 (numeri in grassetto), il ratto B non sbadiglia entro i 3 minuti precedenti (l’intervallo di tempo scelto) o entro quel minuto. In quei minuti, il ratto A sbadiglia per un totale di 2 volte. Pertanto, la frequenza di sbadigli omeno del ratto A senza alcun stimolo di sbadiglio (tasso di sbadiglio non post-post-sbadiglio) è 2/3 (cioè 0,67 sbadigli/min). Nei restanti 9 minuti, il ratto B sbadiglia almeno una volta nello stesso minuto o nei 3 minuti precedenti. RatA sbadiglia un totale di quattro volte in quei 9 min. Pertanto, il tasso di sbadiglio del ratto A in risposta a uno stimolo dello sbadiglio (tasso di sbadiglio post-sbadiglio) è 4/9 (cioè., 0,44 sbadigli/min). L’applicazione della stessa procedura al ratto B produce un tasso di sbadiglio non post-sbadiglio di 2/3 (cioè 0,66) e un tasso di sbadiglio post-yawn di 5/9 (0,55).

D’altra parte, se lo sbadiglio è registrato al decimale più vicino di un minuto, il contagio dello sbadiglio si tradurrà in un tempo post-sbadigliato regolato. Ad esempio, se i seguenti tempi di sbadiglio vengono registrati in un periodo di osservazione di 12 min per i ratti A e B: ratto A (2.3, 5.1, 5.8, 10.4, 10.8, 11.1) e ratto B (1.2, 2.4, 4.5, 5.1, 11.2, 11.6, 11.8). Per il ratto A, i periodi di tempo durante i quali il ratto B non si sbadiglia negli ultimi 3 min vanno da 0 a 1,2 min e da 8,1 a 11,2 min (cioè 3,1 min), che produce un totale di 4,3 min di tempo non post-yawn. Il numero di volte in cui il ratto A sbadiglia in quei periodi è tre (numeri in grassetto), quindi il tasso di sbadiglio non post-yawn è 3/4.3 (cioè 0,69), mentre il tasso di yawn post-yawn è 3/7.7 (cioè 0,38; il denominatore da 12-4,3 min). Allo stesso modo, per il ratto B, i periodi di tempo durante i quali il ratto A non sbadiglia negli ultimi 3 min vanno da 0 a 2,3 min e da 8,8 a 10,4 min, che produce un totale di 3,9 min. Il numero di volte in cui il ratto B si sbava all’interno di tali periodi è uno, quindi il tasso di sbadiglio non post-sbadigliato è 1/3,9 (cioè 0,25). Di conseguenza, il tasso di sbadiglio post-sbadiglio è 6/8.1 (cioè 0,74).

Mentre una corrispondenza quasi-contemporanea nel comportamento è un criterio ideale per dimostrare la presenza di un contagio, aspetti come i vincoli su ciò che un individuo frequenta, il tempo di reazione a uno stimolo, la distribuzione del comportamento nel tempo (ad esempio, lo sbadiglio può verificarsi in episodi), e il tempo di acclimatarsi all’impostazione sperimentale tutti danno origine a differenze di specie, rendendo difficile l’uso di un intervallo di tempo unico. Questo può essere il motivo per cui i ricercatori hanno utilizzato le finestre di tempo che variano da secondi⁵ a diversi minuti¹¹, che crea problemi quando si confrontano i risultati²⁸. Per questo motivo, si propone di ripetere la procedura descritta sopra per una serie di intervalli di tempo per ottenere curve di contagio dello sbadiglio e confrontare le curve di contagio dello sbadiglio tra le specie.

Le curve di contagio dello sbadiglio equivalenti possono essere confrontate distribuendo casualmente il numero di sbadigli osservati per ogni ratto durante il periodo di osservazione. Così, il metodo proposto per misurare il contagio dello sbadiglio offre due tipi di controlli: il tasso di (1) tasso di sbadigli osidio che si verificano al di fuori della finestra temporale (tempo non post-sbadiglia) e (2) curva di contagio dello sbadiglio artificiale ottenuta dalla distribuzione casuale del numero di sbadigli. Pertanto, questo approccio per analizzare il contagio dello sbadiglio è un passo avanti rispetto ad altre procedure, come quelle che confrontano la percentuale o la frequenza dello sbadiglio entro un singolo intervallo di tempo con quelle che si verificano al di fuori di questa finestra²⁵, senza tenere conto del tempi effettivi fotogrammi. Il metodo è completato da un programma basato su R²⁹ per calcolare comodamente e oggettivamente la probabilità di sbadigli contagioso per uno o più intervalli di tempo.

Per illustrare l’utilità di questo metodo e i vantaggi del programma basato su R, viene utilizzato un set di dati da uno studio pubblicato in precedenza^18. La condizione sperimentale consisteva di 144 ratti maschi assegnati a una condizione familiare o sconosciuta. I ratti in ogni condizione sperimentale sono stati suddivisi in quattro sottogruppi di nove coppie ed esposti a una delle quattro situazioni di prova descritte sopra. I comportamenti sbadigli dei ratti in ogni condizione sperimentale e situazione di prova sono stati poi registrati per un periodo di 60 min.

Protocol

I protocolli sperimentali e l’allevamento degli animali sono stati condotti in conformità con gli orientamenti istituzionali. 1. Materiali Trovare un elenco completo dei materiali utilizzati per implementare il metodo nella Tabella dei materiali. Utilizzare la Figura 1 e consultare un esperto per costruire una tabella a forma di T rovesciata, gabbie di osservazione e divisori a gabbia. Seguire le indicazioni di sicurezza per l’uso di ut…

Representative Results

I ratti sono stati selezionati da una sotto-linea di ratti Sprague-Dawley prodotta in precedenza che sono stati selezionati per frequenti sbadigli (circa 22 sbadigli all’ora31). Tuttavia, le nove coppie di ratti maschi sconosciuti e nove di ratti maschi familiari (tra i 2,5 e i 3 mesi di età) utilizzati per situazione di prova sbadigliavano circa 12 volte all’ora, in media18. Pertanto, le situazioni di prova per misurare il contagio dello s…

Discussion

Ci sono passaggi critici nel metodo che devono essere presi in considerazione per ottenere risultati positivi. I ratti familiari devono condividere le gabbie domestiche per almeno 1,5 mesi dopo lo svezzamento e prima di eseguire gli esperimenti. Tuttavia, ratti sconosciuti devono vivere in gabbie separate. In entrambi i casi, le coppie di ratti devono provenire da diverse cucciolate, ma devono essere il più simile possibile in base all’età. Per quanto riguarda le gabbie di osservazione, i loro fori dovrebbero corrispon…

Materials

Acrylic dividers	Handcrafted	Not available	Two dividers, one clear and one opaque, will have 24 holes each. The other two dividers, one clear and one opaque, will have no holes. See the main text for details of construction.
An R-based program	Benemérita Universidad Autónoma de Puebla	Not available	This is the program used to assess yawn contagion in rats. See the main text for information about the way the program is used.
Data sheets	The user can elaborate them	Not available	These forms will be used for the observer to record the frequency of yawning behaviour by viewing the video recordings. Alternatively, a notebook can be use provided you follow the suggestions given in the main text.
Desktop computer	Any maker	Not available	Make sure the computer has a video card capable of conveniently processing the video recordings of yawning behaviour.
Digital camcorders	Any maker	Not available	They will be used to video record yawning behaviour of each pair of rats; there will be 2 pairs of rats per experimental session.
Flash drive	Any maker	Not available	Each experimental session will last 60 min, and so you will require sufficient memory to store the video recording.
Glass cages	Handcrafted	Not available	Each cage (19 X 19 X 10 cm height) will have 24 holes (0.5 cm diameter) forming three rows in the middle of one of its sides. See the main text for more details about their construction. It is recommended to fabricate one extra cage in case one of them is accidentally broken.
Markers	Sharpie or any other maker	Not available	Permanent markers to number the rats. See the main text to see one way of using painting symbols on the rat's tail.
Pencils	Any maker	Not available	They are used by the observer to record the frequency of yawning. It is important that the observer has previously been trained to recognize yawning behaviour and operate the video player system.
R software	R Development Core Team	Not available	Download R at: http://cran.r-project.org/
Rail-like wooden bars	Handcrafted	Not available	They will be fixed in the middle of the rectangular wooden sheet  forming a track, where a second wooden sheet is placed. See the main text for additional instructions for construction.
Rectangular table	Any maker	Not available	This is the table (approximately 2 x 1 m) where the inverted T-shaped table will be placed for performing the observation of yawning behaviour.
Sprague-Dawley male rats	Any local supplier of laboratory animals	Not available	Nine pairs of male rats per test situation are necessary for each group, familiar and unfamiliar rats, because with this sample size the interindividual variation that might exist in yawning frequency will not severely affect the conclusions drawn from the statistical analysis performed to the data.
Spreadsheet software	Microsoft	Not available	Excel will be the software used to store the yawning recordings initially recorded on the data sheets. Revise the main text for instructions about the recommended way of doing the transcription.
Square filter papers	Any maker	Not available	They are used for covering the cage's bottom.
Tripods	Any maker	Not available	They will be used for fixing the camcorders in front of each pair of observation cages.
Wooden Inverted T-shaped table	Handcrafted	Not available	Read the instructions in the main text to see the way of constructing it. If preferred, a different material to wood can be used. Make sure any material is as resistant as possible to the transmission of ultrasounds, which the rats might use for communication.