Protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um Kit de isolamento organela bem estabelecidas
Summary
Este protocolo estabelece um novo método de isolamento de gotículas lipídicas e purificação do fígado de rato, usando um kit de isolamento bem-estabelecida retículo endoplasmático.
Abstract
Gotículas lipídicas (LDs) são bioativas organelas encontradas no citosol do mais eucarióticas e algumas células procarióticas. LDs é composto de lipídios neutros, envolvidos por uma monocamada de fosfolipídios e proteínas. Lipídios de LD hepáticos, tais como as ceramidas e as proteínas estão implicados em várias doenças que causam esteatose hepática. Embora métodos anteriores tenham sido estabelecidos para isolamento de LD, exigem uma preparação demorada dos reagentes e não são projetados para o isolamento de vários compartimentos subcellular. Procuramos estabelecer um novo protocolo para permitir o isolamento de LDs, retículo endoplasmático (ER) e lisossomos de um fígado de rato único.
Além disso, todos os reagentes utilizados no protocolo aqui apresentado estão disponíveis comercialmente e exigem preparação do reagente mínima sem sacrificar a pureza de LD. Aqui nós apresentamos dados comparando este novo protocolo para um protocolo de gradiente de sacarose padrão, demonstrando rendimento, morfologia e pureza comparável. Além disso, podemos isolar ER e lisossomos usando a mesma amostra, fornecendo uma visão detalhada para a formação e o fluxo intracelular de lipídios e suas proteínas associadas.
Introduction
LDs são bioativas organelas encontradas no citosol de células eucarióticas mais e algumas células procarióticas1,2,3. O núcleo de LD é composto de lipídios neutros como triglicérides (TG) e ésteres de colesterol. Eles também contêm ceramidas, lipídios bioativos envolvidos em vias sinalização celular4,5. LDs estão rodeados por uma monocamada de fosfolípidos e revestidos com proteínas, incluindo a perilipin de proteínas perilipin 2 (PLIN2) e 3 (PLIN3)1,5,6. Também presentes estão as enzimas lipogénicos, lipases e proteínas de membrana de tráfico que têm sido associadas a várias doenças steatotic hepáticas, incluindo doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática alcoólica e hepatite C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs é pensado para formar a membrana exterior do PS e conter recentemente sintetizada TG proveniente de ácidos graxos livres de ER-derivado11. No entanto, continua a ser desconhecido se os lipídios em pool Brote, permanecem conectados, ou são extirpado da ER6,11, fazendo o isolamento do LDs livre de ER tecnicamente desafiador. Ácidos graxos livres podem ser liberto de LDs pela ação de lipases superfície para fornecer para a produção de energia ou síntese de membrana. Além disso, LDs pode ser degradado através de lipophagy como um mecanismo regulatório e para a produção de ácidos graxos livres12.
Além do ER e lisossomos, existem outras organelas — tais como endossomos, mitocôndrias, peroxissomos e a membrana plasmática — que são encontrados dentro de estreita associação de LDs11. Esta poligamia apertada dificulta a realizar uma extração LD pura. No entanto, densidade de baixo inata dos lípidos neutros pode ser aproveitada através de de centrifugação5.
Tradicionalmente, LDs têm sido isolado usando um sacarose densidade gradiente1,5,13. No entanto, estes métodos não foram concebidos para isolar outras organelas. Além disso, eles exigem a demorada preparação dos reagentes. Este protocolo se adapta a um isolamento de ER comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais) para permitir o isolamento de LD. Nós usamos o buffer de extração fornecido pelo kit, adicionando uma etapa de isolamento de LD. Além disso, o protocolo também pode ser usado para ER e isolamento dos lisossomos, usando as mesmas amostras, permitindo uma imagem mais abrangente do ciclo de vida do LDs. Para validar este novo método, nós do ensaio rendimento LD, morfologia, tamanho e pureza. Comparamos os resultados aqui apresentados aos obtidos com um protocolo amplamente usado, utilizando um gradiente de sacarose para isolamento de LD.
Usamos um 10 de 12-semanas, 20 g feminino C57BL/6 rato jejuou por 16 h (remoção de comida às 17:00 por um tempo de isolamento do LD de 09:00), com livre acesso à água. O rendimento típico de TG é de 0,6 mg/g fígado, e por proteínas de LD, é 0,25 mg/g fígado. Isto fornece material suficiente para ~ 10 immunoblots por SDS PAGE. O protocolo abaixo detalha os reagentes usados e um protocolo apropriado para um fígado único 1G. O protocolo de isolamento gradiente de sacarose é adaptado do Sato14 e Wu15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hepática biologia LD está cada vez mais sendo reconhecida como um regulador crítico da fisiologia hepatocelular na saúde e na doença. Como organelas de boa-fé, LDs são dinâmico, interagem com outras estruturas celulares e conter dentro os componentes bioativos envolvidos na homeostase lipídica e a glicose. O gradiente de sacarose é usado rotineiramente para isolamento de LD e permite que os investigadores estudar a estrutura da LD, mas os obriga a fazer vários buffers. Nós demonstramos que o uso de um kit de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a família Abramson Cancer Research Institute. Este trabalho é apoiado por subsídios seguintes: NIH/tinham R01 AA026302-01, NIH/tinham K08-AA021424, Fundação Robert Wood Johnson, Harold Amos Medical faculdade desenvolvimento Award, 7158, IDOM RDC piloto prêmio P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/TINHAM F32-AA024347 (JC). Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH P30-DK050306 e programa de concessão de suas instalações de núcleo (Patologia Molecular e Imaging Core, núcleo de expressão de Gene/Biologia Molecular e celular núcleo de cultura) e o seu piloto. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
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