دهن السريع الحبرية العزلة بروتوكول استخدام عدة عزل عضية الراسخة
Summary
هذا البروتوكول يحدد أسلوب رواية الدهن الحبرية العزل وتنقية من كبد الفأر، استخدام عدة عزلة هيولى راسخة.
Abstract
قطرات الدهن (LDs) هي النشطة بيولوجيا العضيات الموجودة داخل سيتوسول الأكثر حقيقية النواة وبعض الخلايا بدائية. قديسي الأيام الأخيرة تتكون من الدهون محايدة المغطى باحادي الطبقة فوسفوليبيدات والبروتينات. الكبد LD الدهون، مثل سيراميد، والبروتينات، ومتورطة في العديد من الأمراض التي تسبب ذلك الكبد. على الرغم من أن الأساليب السابقة أقيمت لعزل LD، أنها تتطلب تحضير تستغرق وقتاً طويلاً من الكواشف وليست مصممة لعزل المقصورات سوبسيلولار متعددة. سعينا إلى وضع بروتوكول جديد لتمكين عزل LDs، هيولى (ER)، وليسوسوميس من كبد واحدة بماوس.
علاوة على ذلك، جميع الكواشف المستخدمة في البروتوكول المعروضة هنا متوفرة تجارياً وتتطلب إعداد كاشف الحد الأدنى دون التضحية بنقاء LD. هنا نقدم بيانات مقارنة هذا البروتوكول الجديد لبروتوكول تدرج سكروز قياسية، مما يدل على نقاء قابلة للمقارنة، ومورفولوجيا والغلة. بالإضافة إلى ذلك، ونحن عزل ER وليسوسوميس باستخدام نفس العينة، توفير تفاصيل أعمق لتشكيل والتمويه داخل الخلايا للدهون والبروتينات المرتبطة بهم.
Introduction
قديسي الأيام الأخيرة هي النشطة بيولوجيا العضيات الموجودة في سيتوسول الخلايا حقيقية النواة أكثر وبعض الخلايا بدائية1،،من23. الأساسية LD يتكون من الدهون محايدة مثل استرات الكولسترول والدهون الثلاثية (TG). كما أنها تحتوي على سيراميد، الدهون النشطة بيولوجيا المتورطين في إرسال الإشارات الخلوية مسارات4،5. دس محاطة أحادي الطبقة فسفوليبيد ومغلفة بالبروتينات، بما في ذلك بيريليبين البروتينات بيريليبين 2 (PLIN2) و 35،1،(PLIN3)6. كما حضر من الإنزيمات ليبوجينيك وليباسيس وبروتينات الغشاء الاتجار غير المشروع التي تم ربطها إلى عدة أمراض الكبد ستيتوتيك، بما في ذلك الدهنية أمراض الكبد وأمراض الكبد الكحولية والالتهاب الكبدي ج3،5 ،،من67،،من89،10.
ويعتقد قديسي الأيام الأخيرة تشكل من الغشاء الخارجي للائحة، وتتضمن المركبة حديثا تيراغرام مصدرها الأحماض الدهنية الحرة المستمدة من أية11. بيد أنه لا يزال غير معروف ما إذا كانت الدهون المجمعة برعم، تظل متصلاً، أو هي اقتطعت من ER6،11، مما يجعل عزل LDs خالية من أية صعوبة من الناحية التقنية. الأحماض الدهنية الحرة يمكن أن يتحرر من LDs العمل الذي قامت به ليباسيس السطحية لتوفير إنتاج الطاقة أو تركيب الغشاء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتحلل LDs عبر ليبوفاجي كآلية تنظيمية وإنتاج الأحماض الدهنية الحرة12.
هناك جانب ER و lysosomes، العضيات الأخرى – مثل الميتوكوندريا، اندوسوميس، بيروكسيسوميس، وغشاء البلازما – التي توجد ضمن الارتباط الوثيق لقديسي الأيام الأخيرة11. هذا تعدد الزوجات ضيق يجعل من الصعب القيام استخراج LD نقية. ومع ذلك، يمكن اتخاذها الفطرية ذات الكثافة السكانية المنخفضة الدهون محايدة ميزة عن طريق الطرد المركزي5.
تقليديا، وقد تم دس عزل استخدام سكروز كثافة متدرجة1،،من513. بيد أن هذه الأساليب قد لا صممت لعزل العضيات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، فإنها تتطلب إعداد الكواشف تستغرق وقتاً طويلاً. يتكيف هذا البروتوكول عزلة ER متاحة تجارياً كيت (انظر الجدول للمواد) للسماح لعزل دينار. ونحن نستخدم استخراج المخزن المؤقت المقدمة من هذه المجموعة، إضافة خطوة عزلة LD. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدام البروتوكول ER وعزل الليزوزومية استخدام العينات نفسها، مما يتيح الحصول على صورة أكثر شمولاً لدورة الحياة لقديسي الأيام الأخيرة. للتحقق من صحة هذا الأسلوب الجديد، ونحن الاعتداء الغلة LD ومورفولوجيا والحجم والنقاء. قارنا النتائج المعروضة هنا لتلك التي تم الحصول عليها مع بروتوكول مستخدمة على نطاق واسع باستخدام تدرج سكروز لعزل LD.
كنا 10 إلى 12 أسبوع-عمرها، الماوس C57BL/6 الإناث 20 غ صام ح 16 (إزالة المواد الغذائية في 05:00 م لمدة عزل LD 09:00 ص) مع حرية الوصول إلى المياه. العائد نموذجية تيراغرام الكبد 0.6 مغ/ز، وهو للبروتين LD، الكبد 0.25 مغ/ز. وهذا يوفر ما يكفي من المواد إيمونوبلوتس ~ 10 بصفحة الحزب الديمقراطي الصربي. البروتوكول أدناه تفاصيل والكواشف المستخدمة وبروتوكول مناسب لكبد واحد ز 1. البروتوكول العزلة التدرج السكروز هو مقتبس من ساتو14 و15من وو.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويجري يتزايد الاعتراف كبدي LD البيولوجيا كمنظم حرجة لفسيولوجيا سرطانه الخلية في الصحة والمرض. العضيات حسنة النية، LDs ديناميكية، تتفاعل مع غيرها من الهياكل الخلوية، وتحتوي على داخل المكونات النشطة بيولوجيا لهم المشاركة في التوازن في الدهون والسكر. تستخدم بشكل روتيني لعزل LD التدرج السكروز …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر معهد بحوث السرطان الأسرة ابرامسون. يتم دعم هذا العمل بالمنح التالية: المعاهد الوطنية للصحة/نياا R01 AA026302-01، والمعاهد الوطنية للصحة/نياا K08-AA021424، مؤسسة روبرت وود جونسون، هارولد آموس الطبية كلية التنمية جائزة، 7158، إيدوم جمهورية الكونغو الديمقراطية الطيار جائزة P30 DK019525 (R.M.C.)؛ المعاهد الوطنية للصحة/نياا F32-AA024347 (كيركراده). وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة P30-DK050306 ومرافقها الأساسية (الباثولوجيا الجزيئية والتصوير، والبيولوجيا الجزيئية/الجينات التعبير الأساسية، خلية الثقافة الأساسية و) وقائدها منح البرنامج. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية “المعاهد الوطنية للصحة”.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
