Hurtig Lipid Droplet Isolation protokollen ved hjælp af en almindelig Organelle isolering Kit
Summary
Denne protokol fastsætter en roman metode af lipid droplet isolering og oprensning fra mus lever, ved hjælp af en veletableret endoplasmatiske reticulum isolering kit.
Abstract
Lipid dråber (LDs) er bioaktive organelles fundet i cytosol af den mest eukaryote og nogle Prokaryote celler. LDs er sammensat af neutrale lipider indkapslet af en éncellelag af fosfolipider og proteiner. Hepatisk LD lipider, ceramider og proteiner er involveret i flere sygdomme, der forårsager hepatisk steatose. Selvom tidligere metoder er blevet fastlagt for LD isolation, de kræver en tidskrævende forberedelse af reagenser og er ikke beregnet til isolering af flere subcellulært rum. Vi forsøgte at etablere en ny protokol for at aktivere isolering af LDs, endoplasmatiske reticulum (ER) og lysosomer fra en enkelt mus lever.
Yderligere, alle reagenser, der anvendes i den protokol, der præsenteres her er kommercielt tilgængelige og kræver minimal reagens uden at ofre LD renhed. Her præsenterer vi data sammenligner denne nye protokol til en standard saccharose gradient protokol, demonstrere sammenlignelige renhed, morfologi og udbytte. Derudover kan vi isolere ER og lysosomer ved hjælp af den samme prøve, giver detaljeret indsigt i dannelsen og intracellulære flux af lipider og deres tilknyttede proteiner.
Introduction
LDs er bioaktive organelles fundet i cytosol af mest eukaryote celler og nogle Prokaryote celler1,2,3. LD kernen er sammensat af neutrale lipider som triglycerid (TG) og kolesterol estere. De indeholder også ceramider, bioaktive lipider involveret i cellulære signaling veje4,5. LDs er omgivet af en phospholipid éncellelag og belagt med proteiner, herunder perilipin proteiner perilipin 2 (PLIN2) og 3 (PLIN3)1,5,6. Også til stede er lipogenic enzymer, lipaser og membran menneskehandel proteiner, der har været knyttet til flere hepatisk steatotic sygdomme, herunder ikke-alkoholiske fedtlever sygdom, alkoholisk leversygdom og hepatitis C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs menes at danne fra den ydre membran af Skadestuen og indeholde nyligt syntetiserede TG stammer fra ER-afledte frie fedtsyrer11. Men det er stadig ukendt om de poolede lipider bud, forblive tilsluttet, eller er skåret ud fra de ER6,11, at isolationen af LDs gratis fra ER teknisk udfordrende. Frie fedtsyrer kan blive befriet fra LDs ved hjælp af overflade lipaser at fastsaette energiproduktion eller membran syntese. Derudover kan LDs nedbrydes via lipophagy, som en reguleringsmekanisme og producere frie fedtsyrer12.
Udover ER og lysosomer, findes der andre organeller — som mitokondrier, endosomes, peroxisomer og plasmamembran — der findes inden for nære LDs11. Denne stramme polygami gør det vanskeligt at udføre en ren LD udvinding. Imidlertid kan neutral lipider medfødte lav tæthed udnyttes via centrifugering5.
LDs har traditionelt været isoleret ved hjælp af en saccharose tæthed gradient1,5,13. Men disse metoder ikke er designet til at isolere andre organeller. Desuden kræver de tidskrævende forberedelse af reagenser. Denne protokol tilpasser en kommercielt tilgængelig ER isolering kit (Se Tabel af materialer) for at muliggøre LD isolation. Vi bruger ekstraktionsbuffer leveres af kit, tilføje en LD isolation trin. Protokollen kan desuden også bruges til ER og lysosomale isolation ved hjælp af de samme prøver, giver mulighed for en mere omfattende billede af LDs livscyklus. Hvis du vil validere denne nye metode, assay vi LD udbytte, morfologi, størrelse og renhed. Vi sammenligner resultaterne præsenteres her til dem, der opnås med en udbredte protokol udnytter en saccharose gradient til LD isolation.
Vi brugte en 10 til 12-uger gamle, 20 g kvindelige C57BL/6 mus fastede for 16 h (mad fjernelse i 9:00 A.M. LD isolation tid kl) med fri adgang til vand. Det typiske afkast for TG er 0,6 mg/g lever, og for LD protein, det er 0,25 mg/g lever. Dette giver nok materiale til ~ 10 immunoblots af SDS side. Protokollen under detaljer de reagenser og en protokol, der er egnet til en enkelt 1 g lever. Saccharose gradient isolation protokol er tilpasset fra Sato14 og Wu15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hepatisk LD biologi anerkendes i stigende grad som en kritisk regulator af hepatocellulært fysiologi i både sundhed og sygdom. Som bona fide organeller, LDs er dynamiske, interagere med andre cellulære strukturer og indeholde inden for dem bioaktive komponenter involveret i både lipid og glukose homøostase. Saccharose gradient bruges rutinemæssigt til LD isolation og gør det muligt for efterforskerne at studere LD struktur, men det kræver dem til at gøre mange buffere. Vi har vist, at brug af et kommercielt tilg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Abramson familie Cancer Research Institute. Dette arbejde støttes af følgende tilskud: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medicinske fakultet udvikling Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (JC). Dette arbejde blev delvist understøttet af NIH P30-DK050306 og dens kerne faciliteter (Molekylær Patologi og Imaging Core, molekylær biologi/gen Expression kerne og celle kultur Core) og dens pilot tilskud program. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
