Snelle lipide Droplet isolatie Protocol met behulp van een gerenommeerd organel isolatie Kit
Summary
Dit protocol voorziet een nieuwe methode van lipide druppel isolatie en zuivering van muis levers, met behulp van een gevestigde endoplasmatisch reticulum isolatie kit.
Abstract
Lipide druppels (LDs) zijn bioactieve organellen binnen het cytosol van de meeste eukaryotische en sommige prokaryote cellen gevonden. LDs bestaan uit neutrale lipiden ingekapseld door een monolayer van fosfolipiden en eiwitten. Hepatische LD lipiden, zoals Ceramiden en eiwitten zijn betrokken bij verschillende ziekten die leiden hepatische steatosis tot. Hoewel vorige methoden zijn vastgesteld voor LD isolatie, ze vereisen een tijdrovende voorbereiding van reagentia en zijn niet bedoeld voor de isolatie van meerdere subcellular compartimenten. We geprobeerd om een nieuw protocol zodat het isolement van de LDs, endoplasmatisch reticulum (ER) en lysosomen uit de lever van een simpele muisklik.
Verder alle reagentia gebruikt in het protocol hier gepresenteerd zijn commercieel verkrijgbaar en vereisen minimaal reagens voorbereiding zonder in te boeten LD zuiverheid. Hier presenteren we gegevens vergelijken van dit nieuwe protocol aan een standaard sacharose kleurovergang protocol, vergelijkbare zuiverheid, morfologie en opbrengst demonstreren. Bovendien, kunnen we isoleren ER en lysosomen met behulp van hetzelfde monster, gedetailleerde inzicht bijbrengen in de vorming en de intracellulaire flux van lipiden en hun geassocieerde eiwitten.
Introduction
LDs zijn bioactieve organellen gevonden in het cytosol meest eukaryotische cellen en sommige prokaryotische cellen1,2,3. De LD-kern bestaat uit neutrale lipiden zoals triglyceriden (TG) en cholesterol esters. Ze bevatten ook Ceramiden, bioactieve lipiden die betrokken zijn bij cellulaire signalering trajecten4,5. LDs zijn omgeven door een fosfolipide enkelgelaagde en bekleed met eiwitten, met inbegrip van de perilipin eiwitten perilipin 2 (PLIN2) en 3 (PLIN3)1,5,6. Ook aanwezig zijn lipogenic enzymen, lipasen en mensenhandel membraaneiwitten die zijn gekoppeld aan verschillende hepatische steatotic ziekten, met inbegrip van vette leverziekte en alcoholische leverziekte hepatitis C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs worden verondersteld om te vormen van de buitenmembraan van de ER en nieuw samengestelde TG afkomstig uit vrije vetzuren ER afkomstige11bevatten. Het blijft echter onbekend of de gepoolde lipiden bud, verbonden blijven, of worden weggesneden uit het ER6,11, waardoor het isolement van LDs vrij van ER technisch uitdagende. Vrije vetzuren kunnen worden bevrijd uit LDs door de inwerking van oppervlakte lipasen energieproductie of membraan synthese te voorzien. Bovendien kunnen de LDs via lipophagy worden afgebroken als een regelgevende mechanisme en voor de productie van vrije vetzuren12.
Naast de ER en lysosomen, zijn er andere organellen — zoals mitochondriën, Endosomen, peroxisomen en het plasma membraan — die zijn te vinden in nauwe samenwerking van LDS-11. Deze strakke polygamie maakt het moeilijk om uit te voeren van een zuivere LD-extractie. Echter, neutrale lipiden aangeboren lage dichtheid kan worden benut via centrifugeren5.
Traditioneel, zijn LDs geïsoleerd met behulp van een sacharose dichtheid kleurovergang1,5,,13. Deze methoden zijn echter niet ontworpen om te isoleren van andere organellen. Bovendien vereisen ze de tijdrovende voorbereiding van reagentia. Dit protocol past een verkrijgbare ER isolatie kit (Zie de Tabel van materialen) om LD isolatie voorzien. We gebruiken de buffer van de extractie geboden door de kit, een LD isolatie stap toe te voegen. Bovendien kan het protocol ook worden gebruikt om ER en lysosomale isolatie met behulp van de dezelfde monsters, waardoor een vollediger beeld van de hele levenscyclus van LDs. Voor het valideren van deze nieuwe methode, assay wij LD opbrengst, de morfologie, de grootte en de zuiverheid. We vergelijken de resultaten die hier gepresenteerd die verkregen met een gebruikte protocol met behulp van een kleurovergang van sacharose voor LD isolatie.
We gebruikten een 10 – tot 12-weken oude, 20 g vrouwelijke C57BL/6 muis gevast voor 16 h (voedsel verwijdering op 17.00 uur voor een 9.00 LD isolatie keer) met gratis toegang tot water. De typische opbrengst voor TG is 0,6 mg/g lever, en voor LD eiwit, het is 0,25 mg/g lever. Dit biedt genoeg materiaal voor 10 ~ immunoblots door SDS-PAGE. Het protocol hieronder details de gebruikte reagentia en een protocol geschikt voor een enkele 1 g lever. Het protocol van de kleurovergang isolatie sacharose is aangepast van Sato14 en Wu15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hepatische LD biologie wordt steeds meer erkend als een belangrijke regulator van hepatocellulaire fysiologie in zowel de volksgezondheid als de ziekte. Als bonafide organellen, LDs zijn dynamische interactie met andere cellulaire structuren en bevatten binnen hen bioactieve componenten betrokken bij zowel lipide en glucose homeostase. Het verloop van sacharose wordt routinematig gebruikt voor LD isolatie en kan onderzoekers bestuderen LD structuur, maar het vereist hen om talrijke buffers. We hebben aangetoond dat het g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de Abramson familie Cancer Research Institute. Dit werk wordt ondersteund door de volgende subsidies: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation Harold Amos medische faculteit Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.C.M.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH P30-DK050306 en de faciliteiten van de kern (moleculaire pathologie en Imaging Core, moleculaire biologie/gen expressie Core en cel cultuur Core) en haar piloot verlenen programma. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
