Protocole d’isolement de gouttelettes lipidiques rapide à l’aide d’un Kit d’Isolation des organites bien établie
Summary
Ce protocole établit une nouvelle méthode d’isolement de gouttelettes lipidiques et la purification du foie de souris, à l’aide d’un kit d’isolation bien établie du réticulum endoplasmique.
Abstract
Gouttelettes lipidiques (LDs) sont des organites bioactifs trouvés dans le cytosol de la plupart des eucaryotes et certaines cellules procaryotes. LDs sont composées de lipides neutres enveloppés par une monocouche de phospholipides et de protéines. Les lipides LD hépatiques, tels que les céramides et les protéines sont impliquées dans plusieurs maladies qui causent une stéatose hépatique. Bien que les méthodes précédentes ont été établies pour l’isolement de la LD, ils nécessitent une longue préparation des réactifs et ne sont pas conçus pour l’isolement de plusieurs compartiments subcellulaires. Nous avons cherché à établir un nouveau protocole permettant l’isolement de LDs, réticulum endoplasmique (re) et de lysosomes une seule foie de souris.
En outre, tous les réactifs utilisés dans le protocole présenté ici sont disponibles commercialement et requièrent une préparation minimale réactif sans sacrifier la pureté de la LD. Ici, nous présentons des données comparant ce nouveau protocole à un protocole de gradient de saccharose standard, démontrant le rendement, la morphologie et la pureté comparable. En outre, nous pouvons isoler ER et les lysosomes en utilisant le même exemple, donnant un aperçu détaillé dans la formation et le flux intracellulaire des lipides et les protéines associées.
Introduction
LDs sont des organites bioactifs dans le cytosol des cellules eucaryotes plus et certaines cellules procaryotes1,2,3. L’âme de LD est composée de lipides neutres tels que les esters de cholestérol et de triglycérides (TG). Elles contiennent également des céramides, lipides bioactifs impliqués dans cellulaire signalisation voies4,5. LDs sont entourés d’une monocouche de phospholipides et recouvert de protéines, y compris le perilipin protéines perilipin 2 (PLIN2) et 3 (PLIN3)1,5,6. Sont également présents lipogenic enzymes lipases et des protéines membranaires trafic qui ont été associées à plusieurs maladies de stéatose hépatiques, y compris la stéatose hépatique non-alcoolique, maladie alcoolique du foie et l’hépatite C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs sont censés se forment de la membrane externe de l’ER et contiennent nouvellement synthétisée TG provenant des acides gras dérivés ER11. Cependant, il reste inconnu si les lipides regroupées IUN, connectés en permanence, ou sont excisés de l’ER6,11, rendant l’isolement de LDs exempts de ER techniquement difficile. Acides gras libres peut être libérées de LDs par l’action des lipases surfaces de prévoir la production d’énergie ou de la synthèse de la membrane. En outre, LDs peuvent être dégradées par l’intermédiaire de lipophagy comme un mécanisme de régulation et de produire des acides gras libres,12.
Outre l’ER et les lysosomes, il y a des autres organites — comme les mitochondries, endosomes, peroxysomes et la membrane plasmique — qui se trouvent au sein de l’association étroite de LDs11. Cette polygamie serrée, il est difficile d’effectuer une extraction pure de la LD. Cependant, densité faible innée des lipides neutres peut être mises à profit par centrifugation5.
Traditionnellement, le LDs ont été isolés à l’aide d’un saccharose densité gradient1,5,13. Cependant, ces méthodes n’ont pas été conçus pour isoler les autres organites. En outre, ils exigent la longue préparation des réactifs. Ce protocole s’adapte un isolement ER commercialement disponible nécessaire (voir la Table des matières) pour permettre à l’isolement de la LD. Nous utilisons le tampon d’extraction fourni par le kit, en ajoutant une étape d’isolement de LD. En outre, le protocole peut également servir pour ER et l’isolement lysosomal en utilisant les mêmes échantillons, ce qui permet une image plus complète du cycle de vie de LDs. Pour valider cette nouvelle méthode, nous dosage LD rendement, morphologie, taille et la pureté. Nous comparons les résultats présentés ici à celles obtenues avec un protocole largement utilisé en utilisant un gradient de saccharose pour l’isolement de la LD.
Nous avons utilisé un 10 à 12-week-old, souris C57BL/6 femelle de 20 g à jeun pendant 16 h (retrait de nourriture à 17:00 pendant une période d’isolement de LD 09:00) avec un accès gratuit à l’eau. Le rendement typique de TG est de 0,6 mg/g de foie, et pour la protéine LD, c’est 0,25 mg/g de foie. Ceci fournit suffisamment d’éléments pour l’immuno-blot ~ 10 par SDS PAGE. Le protocole ci-dessous détaille les réactifs utilisés et un protocole adapté à un foie unique de 1 g. Le protocole d’isolement dégradé de saccharose est adapté de Sato,14 et15de la Wu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biologie hépatique de LD n’est plus en plus reconnue comme un régulateur critique de physiologie hépatocellulaire dans santé et maladie. Organites de bonne foi, LDs sont dynamiques, interagir avec d’autres structures cellulaires et contiennent au sein des composants bioactifs eux impliqués dans l’homéostasie des lipides et de glucose. Le gradient de saccharose est couramment utilisé pour l’isolement de la LD et permet aux chercheurs d’étudier la structure de la LD, mais aurait besoin de faire de nombreu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la famille de Abramson Cancer Research Institute. Ce travail est soutenu par les subventions suivantes : NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos Medical Faculty Development Award, 7158, IDOM RDC pilote prix P30 DK019525 (R.M.C.) ; NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Ce travail a été soutenu en partie par le NIH P30-DK050306 et ses installations de base (pathologie moléculaire et Imaging Core, biologie moléculaire/Gene Expression Core et Core de Culture de cellules) et son projet pilote du programme de subventions. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
