Rasche Lipid Droplet Isolation Protokoll verwendet eine gut etablierte Organell-Isolierungskit
Summary
Dieses Protokoll stellt eine neuartige Methode der Lipid Droplet Isolation und Reinigung von Maus Lebern, mit einem etablierten endoplasmatische Retikulum Isolierung-Kit.
Abstract
Lipid-Tröpfchen (LDs) sind bioaktive Organellen innerhalb der Zellflüssigkeit der meisten eukaryotischen und einige prokaryotischen Zellen gefunden. Kirche Jesu Christi bestehen aus neutralen Lipiden, umhüllt von einer Monoschicht von Phospholipiden und Proteinen. Hepatische LD Lipide, wie Ceramide und Proteine sind in mehrere Krankheiten verwickelt, die hepatische Steatose verursachen. Obwohl die bisherige Methoden für LD isoliert aufgestellt wurden, sie erfordern eine aufwändige Vorbereitung der Reagenzien und eignen sich nicht für die Isolierung von mehreren subzelluläre Kompartimente. Wir wollten ein neues Protokoll zu ermöglichen, die Isolation der LDs, endoplasmatische Retikulum (ER) und Lysosomen aus einem einzigen Mausklick Leber zu etablieren.
Weitere, alle Reagenzien im hier vorgestellten Protokoll sind im Handel erhältlich und erfordern minimale Reagenz Vorbereitung ohne Einbußen bei der LD Reinheit. Hier stellen wir Vergleiche dieses neue Protokoll zu einem standard Saccharose-gradient-Protokoll zeigen vergleichbare Reinheit, Morphologie und Ertrag. Darüber hinaus können wir ER Lysosomen mit der gleichen Probe isolieren und detaillierte Einblicke in die Entstehung und intrazellulären Flux von Lipiden und ihre assoziierten Proteinen.
Introduction
Kirche Jesu Christi sind bioaktive Organellen in der Zellflüssigkeit der meisten eukaryotischen Zellen und einige prokaryotische Zellen1,2,3gefunden. Der LD-Kern besteht aus neutralen Lipiden wie Triglyceride (TG) und Cholesterin-Ester. Sie enthalten auch Ceramide, bioaktiver Lipide zellulären Signal-Wege4,5beteiligt. LDs sind umgeben von einem Phospholipid Monolage und beschichtet mit Proteinen, einschließlich der Perilipin Proteine Perilipin 2 (PLIN2) und 3 (PLIN3)1,5,6. Anwesend sind auch Lipogenic Enzyme Lipasen und Menschenhandel Membranproteine, die mehrere hepatischen steatotic Krankheiten, einschließlich Nichtalkoholische Fettleber, alkoholische Leberkrankheit und Hepatitis C3,5 verbunden ,6,7,8,9,10.
Hlt werden gedacht, um von der äußeren Membran von der Notaufnahme bilden und enthalten neugebildete TG von freien Fettsäuren ER abgeleitet11bezogen. Es bleibt jedoch unbekannt, ob die gepoolten Lipide Knospe, verbunden bleiben, oder werden herausgeschnitten, aus der ER6,11, so dass die Isolierung des LDs befreit ER technisch anspruchsvoll. Freie Fettsäuren können durch die Wirkung der Oberfläche Lipasen vorzusehen, Energieerzeugung oder Membran-Synthese von LDs befreit werden. Darüber hinaus können LDs über Lipophagy als Regelmechanismus und freie Fettsäuren12produzieren abgebaut werden.
Neben der ER und Lysosomen, gibt es andere Organellen – z. B. Endosomen, Mitochondrien, Peroxisomen und die Plasmamembran – in enger Zusammenarbeit von LDs11enthalten sind. Diese engen Polygamie macht es schwierig, eine reine LD-Extraktion durchführen. Jedoch kann neutrale Lipide angeborenen geringer Dichte durch Zentrifugation5genutzt werden.
Traditionell wurden LDs isoliert mit einer Saccharose Dichte Gradienten1,5,13. Jedoch wurden diese Methoden nicht so andere Organellen zu isolieren. Darüber hinaus benötigen sie die zeitraubende Vorbereitung der Reagenzien. Dieses Protokoll passt eine handelsübliche ER Isolation kit (siehe die Tabelle der Materialien), um LD Isolierung zu ermöglichen. Wir verwenden die Extraktionspuffer zur Verfügung gestellt durch das Kit einen LD Isolierung Schritt hinzugefügt. Darüber hinaus kann das Protokoll auch für ER und lysosomale Isolation unter Verwendung der gleichen Proben, damit ein umfassenderes Bild des Lebenszyklus von LDs verwendet werden. Um diese neue Methode zu überprüfen, überprüfen wir LD Ertrag, Morphologie, Größe und Reinheit. Wir vergleichen die Ergebnisse, die hier zu denen, die mit einem weit verbreiteten Protokoll unter Verwendung einer Saccharose Steigung für LD-Isolierung.
Wir verwendeten eine 10 bis 12-Wochen alten, 20 g weiblichen C57BL/6 Maus fastete für 16 h (Essen Entfernung um 17:00 09:00 LD Isolierung Zeit) mit freiem Zugang zu Wasser. Die typische Ausbeute für TG beträgt 0,6 mg/g Leber, und es ist für LD Protein, 0,25 mg/g Leber. Dies bietet genügend Material für ~ 10 Immunoblots von SDS-PAGE. Das Protokoll unten Details der verwendeten Reagenzien und ein Protokoll für eine einzelne 1 g Leber geeignet. Die Saccharose gradient Isolierung Protokoll ist Sato14 und Wu15angepasst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hepatische LD Biologie werden zunehmend als kritische Regulator des hepatozellulären Physiologie in Gesundheit und Krankheit erkannt. Als bona fide Organellen LDs sind dynamisch, interagieren mit anderen Zellstrukturen und enthalten innerhalb Sie bioaktive Komponenten Lipid- und Glukose Homöostase beteiligt. Die Saccharose Steigung wird routinemäßig für LD Isolierung eingesetzt und ermöglicht Ermittler LD Struktur untersuchen, aber es zwingt sie zu zahlreichen Puffer zu machen. Wir haben gezeigt, dass die Verwendun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Abramson Familie Cancer Research Institute. Diese Arbeit wird unterstützt durch folgende Zuschüsse: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos Medical Faculty Development Award, 7158, IDOM DRK Pilot Award P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH P30-DK050306 unterstützt und seine Kern-Einrichtungen (Molekularpathologie und Imaging Core, Molekularbiologie/Gene Expression Kern und Kultur Zellkern) und der Pilot Programm gewähren. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
