השומנים מהירה Droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון
Summary
פרוטוקול זה יוצר שיטה של השומנים droplet בידוד והיטהרות מן העכבר כבדים, באמצעות ערכת בידוד ומבוססת רשתית תוך-פלזמית.
Abstract
השומנים טיפות (LDs) הם ביו organelles נמצא בתוך ציטוזול את האיקריוטיים, כמה תאים prokaryotic. LDs מורכבים ליפידים ניטרלי עטוף ידי טפט של פוספוליפידים וחלבונים. שומנים LD הכבד, כגון סרמידים חלבונים הם מעורבים כמה מחלות הגורמות steatosis כבדית. למרות שיטות קודמות הוקמו לבידוד LD, הן דורשות זמן הכנה של ריאגנטים, שלא תוכננו עבור בידודו של תאים subcellular מרובים. אנחנו ביקשו להקים פרוטוקול חדש כדי לאפשר את ניתוקה של LDs רשתית תוך-פלזמית (ER), lysosomes של כבד עכבר אחת.
זה עוד רחוק, ריאגנטים כל שימוש בפרוטוקול המובאים כאן הם זמינים מסחרית ודורשים הכנה ריאגנט מינימלי מבלי להתפשר על טוהר LD. כאן אנו מציגים נתונים השוואת פרוטוקול חדש זה לפרוטוקול הדרגתיות סוכרוז סטנדרטי, הוכחת טוהר דומות, מורפולוגיה, ועם תשואה. בנוסף, נוכל לבודד ER ו- lysosomes שימוש באותה דגימת זרע, מתן נתונים היסטוריים תובנה היווצרות, שטף תאיים של שומנים וחלבונים הקשורים שלהם.
Introduction
LDs הם ביו organelles נמצא את ציטוזול של התאים האיקריוטיים, כמה תאים prokaryotic1,2,3. ליבת LD מורכב ליפידים נייטרלי כמו האסטרים כולסטרול טריגליצרידים (TG). הם גם מכילים סרמידים, מעורב הסלולר איתות המסלולים4,5ביואקטיביות שומנים. LDs מוקף של טפט פוספוליפיד, מצופה עם חלבונים, כולל את perilipin חלבונים perilipin 2 (PLIN2) ו- 3 (PLIN3)1,5,6. גם בהווה הם אנזימים lipogenic, lipases וקרום חלבונים סחר אשר קושרו מספר מחלות הכבד steatotic, כולל מחלת כבד שומני, מחלת כבד אלכוהולית של הפטיטיס C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs נחשבים טופס של הממברנה החיצונית של המיון ולהכיל TG לאחרונה מסונתז הטרייה ER-derived חומצות שומן בחינם11. עם זאת, נותר לא ידוע אם ליפידים במאגר באד, להישאר מחובר, או הדליות ה ER6,11, שהופך את ניתוקה של תעודות זהות ללא מיון טכנית מאתגר. חומצות שומן בחינם מנחים של תעודות זהות על-ידי הפעולה של פני השטח lipases כדי לספק ייצור אנרגיה או קרום סינתזה. בנוסף, LDs יכול להיות מושפל ויה lipophagy בתור מנגנון רגולטורי וכדי לייצר חומצות שומן בחינם12.
מלבד ER lysosomes, ישנם אחרים organelles — כגון המיטוכונדריה, endosomes, peroxisomes וקרום פלזמה — זה נמצאים בתוך האגודה קרוב של LDs11. פוליגמיה חזק זה מקשה לבצע מיצוי טהור של LD. עם זאת, צפיפות נמוכה מולדת של ליפידים נייטרלי ניתן לקחת לנצל באמצעות צנטריפוגה5.
באופן מסורתי, LDs היו מבודדים באמצעות סוכרוז דחיסות צבע1,5,13. עם זאת, שיטות אלה לא תוכננו כדי לבודד organelles אחרים. בנוסף, הם דורשים את הכנת ריאגנטים גוזלת זמן. פרוטוקול זה מסתגל של בידוד בחדר המיון זמינים מסחרית קיט (ראה את הטבלה של חומרים) כדי לאפשר בידוד LD. אנו משתמשים המאגר שאיבה שסופק על-ידי ערכת, הוספת שלב בידוד LD. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש גם עבור מיון ובידוד lysosomal באמצעות הדגימות אותו, ומאפשר תמונה מקיפה יותר של מחזור החיים של תעודות זהות. לאימות שיטה חדשה, אנחנו assay LD התשואה, מורפולוגיה, לגודל ו טוהר. אנו משווים את התוצאות המובאות לאלו שהושגו עם פרוטוקול נפוץ ניצול הדרגתי סוכרוז לבידוד LD.
השתמשנו של 10 עד 12-בת, 20 גרם הנשי C57BL/6 העכבר התענה עבור 16 h (הסרת מזון בשעה חמש בערב במשך תקופה של בידוד LD 9.00 A.M.) עם גישה חופשית למים. התשואה טיפוסי של TG 0.6 מ ג/גרם כבד, LD חלבון, זה הכבד 0.25 mg/g. זה מספק מספיק חומר immunoblots ~ 10 מאת דף מרחביות. הפרוטוקול להלן הפרטים ריאגנטים בשימוש, פרוטוקול מתאים כבד יחיד 1 g. פרוטוקול בידוד הדרגתיות סוכרוז מותאמת של סאטו14 ו וו15.
Protocol
Representative Results
Discussion
ביולוגיה LD הכבד יותר ויותר להיות מזוהה הרגולטור קריטי של hepatocellular הפיזיולוגיה על בריאות ומחלה. כמו organelles בתום-לב, LDs הם דינמיים, אינטראקציה עם מבנים אחרים התאית, להכיל בתוך אותם רכיבים ביו-אקטיביים מעורב הומאוסטזיס השומנים והן גלוקוז. מעבר הצבע סוכרוז באופן שגרתי משמש לבידוד LD ומאפשרת החוק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים במכון לחקר סרטן משפחת אברמסון. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים הבאים: R01 NIH/NIAAA AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, רוברט ווד ג’ונסון קרן, הרולד עמוס רפואי פיתוח פרס הפקולטה, 7158, IDOM הרפובליקה הדמוקרטית של קונגו טייס פרס P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (ג’יי). עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי NIH P30-DK050306 ולהעניק במתקניה הליבה (פתולוגיה מולקולרית, הדמיה הליבה בביולוגיה מולקולרית/ג’ין הביטוי ליבה, תא תרבות הליבה) וטייס התוכנית. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
