老舗のオルガネラの分離キットを使用して急速な脂質液滴の隔離のプロトコル
Summary
このプロトコルは、脂質液滴分離と老舗の小胞体分離キットを使用して、マウス肝臓から精製法を確立します。
Abstract
脂肪滴 (LDs) が最も真核生物と原核細胞の細胞質内にある生理活性細胞小器官です。LDs は、中性脂質はリン脂質とタンパク質の膜によって包まれて構成されます。肝の LD 脂質、セラミド、タンパク質などは、脂肪肝を引き起こすいくつかの病気に関与しています。以前の方法は LD の分離のために設けられて、彼ら試薬の時間のかかる準備を必要とする、複数の細胞内コンパートメントの分離のために設計されていません。我々 は単一のマウス肝リソソーム、小胞体 (ER)、LDs の分離を有効にする新しいプロトコルを確立しようとしました。
さらに、ここで提示されたプロトコルで使用されるすべての試薬は市販、LD の純度を損なうことがなく最小限の試薬の準備を必要とします。ご紹介ショ糖勾配プロトコルでは、この新しいプロトコルの比較データと同等の純度や形態、収量を示します。さらに、私たちを分離できます ER と同じサンプルを使用して形成と脂質との関連タンパク質の細胞内のフラックスに詳細な洞察力を提供します。
Introduction
LDs は、真核生物細胞の細胞質およびいくつかの原核細胞1,2,3生理活性細胞小器官。LD コアは、中性脂質はトリグリセリド (TG) とコレステロールのエステルなどから構成されています。それらはまた細胞シグナリング経路4,5に関与する生理活性脂質セラミドを含んでいます。LDs はリン脂質の膜に囲まれた、perilipin 蛋白質 perilipin 2 (PLIN2) と 3 (PLIN3)1,5,6を含むタンパク質でコーティングします。また現在は脂肪酸合成系酵素、リパーゼと非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性肝疾患と C 型肝炎3,5 を含むいくつかの肝 steatotic の病気にリンクされている膜輸送タンパク質 ,6,7,8,9,10。
LDs は、小胞体の外側の膜から形成し、小胞体由来の遊離脂肪酸11から新たに合成された TG を含むと考えられています。しかし、それは不明のままプールされた脂質が芽かどうか接続したまままたは、ER6,11, LDs の技術的に挑戦的な小胞体からの分離を行うから摘出しました。遊離脂肪酸は、エネルギー生産や膜の合成を提供する表面リパーゼの作用によって LDs から解放することができます。また、LDs は、調節機構と遊離脂肪酸12を生成する lipophagy を介して低下する可能性が。
小胞体、リソソームのほかは、他の細胞器官-ミトコンドリア、エンドソーム、ペルオキシソーム、原形質膜など-LDs11の密接な関係内に発見されています。このタイトな一夫多妻制では、純粋な LD 抽出を実行する困難になります。しかし、中性脂質の生得的な低密度活用できますの遠心分離5を介して。
伝統的に、LDs はショ糖密度勾配1,5,13を使用して分離されています。ただし、これらのメソッドは、他の細胞器官の分離にない設計されています。また、試薬の時間のかかる準備が必要です。このプロトコルの適応市販小胞体分離 (材料の表を参照) をキット LD 分離を可能にします。我々 は、LD 分離ステップを追加するキットによって提供される抽出バッファーを使用します。さらに、プロトコルは、小胞体、リソソームの分離が LDs のライフ サイクルのより包括的なイメージを可能にする、同じサンプルを使用しての使用もできます。この新しい方法を検証するため、我々 の LD 収量、形態、サイズ、および純度試金します。LD 分離のショ糖密度勾配を利用した広く使用されているプロトコルで得られたものにここで提示される結果を比較する.
20 g 女性 c57bl/6 マウス断食 16 h (9 LD 分離時間の 17 時の食品除去) 水への無料アクセスと、我々 は、10-12 週-旧を使用します。TG の典型的な利回りは 0.6 mg/g 肝臓と LD 蛋白質それは 0.25 mg/g の肝。これは SDS のページで 10 ~ immunoblots の十分な材料を提供します。以下のプロトコルは、使用される試薬および単一 1 g 肝臓に適したプロトコルについて説明します。サッカロースの勾配の隔離のプロトコルは、佐藤14武15から適応されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
肝の LD の生物学はますます健康と病気で肝細胞生理学の重要な調節因子として認識されています。真正な細胞小器官として LDs は動的な他の細胞構造と対話し、中糖・脂質のホメオスタシスに関与するそれらの生理活性成分が含まれて。ショ糖密度勾配 LD 分離に日常的に使用でき、LD の構造を研究する研究者が、それの多数のバッファーを作成する必要があります。我々 は変動への応答に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アブラムソン家族がん研究所に感謝いたします。この作業は次の補助金によってサポートされて: ハロルド ・ アモス医学部開発賞、ロバート ・ ウッド ・ ジョンソン財団、NIH/NIAAA K08 AA021424 NIH/NIAAA R01 AA026302-01 7158、IDOM コンゴ民主共和国パイロット賞 P30 DK019525 (R.M.C.);NIH/NIAAA F32 AA024347 (J. C.)。この作品は NIH P30-DK050306 によって部分で支えられましたし、(分子病理学とコアのイメージング、分子生物学・遺伝子発現コア細胞文化の中心) の中核施設とそのパイロット プログラムを与えます。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
