음 세포 기관이 격리 키트를 사용 하 여 급속 한 지질 작은 물방울 격리 프로토콜
Summary
이 프로토콜 지질 작은 물방울 고립과 확고 바인딩과 그물 격리 키트를 사용 하 여 마우스 간에서 정화의 새로운 방법을 설정 합니다.
Abstract
지질 작은 물방울 (LDs)는 가장 진 핵 어떤 prokaryotic 세포의 cytosol 내 생리 세포. LDs는 인지질과 단백질의 단층에 의해 쌌 다 중립 지질 구성 됩니다. 간장 LD 지질, ceramides, 및 단백질 등 간 steatosis의 원인이 여러 가지 질병에 연루 됩니다. 이전 방법 LD 격리에 대 한 설립 되었습니다, 하지만 그들은 시 약의 준비 시간이 필요 하 고 여러 subcellular 구획의 격리에 대 한 설계 되지 않았습니다. 우리 민 변, 바인딩과 그물 (응급실), 및 단일 마우스 간에서 리소좀의 격리 수 있도록 새로운 프로토콜을 확립 하고자 했다.
더, 여기에 제시 된 프로토콜에 사용 된 모든 시 약 상업적으로 사용할 수 있으며 LD 순수성을 희생 하지 않고 최소한의 시 약 준비 필요. 여기 우리가 비교 순 결, 형태학, 고 수율을 보여주는 데이터를이 새로운 프로토콜 표준 자당 그라데이션 프로토콜을 비교 제시. 또한, 우리가 격리 수 응급실과 같은 샘플을 사용 하 여 리소좀 형성 및 지질 및 그들의 관련 된 단백질의 세포내 유량으로 상세한 통찰력을 제공.
Introduction
LDs는 생리 세포 가장 진 핵 세포의 cytosol 그리고 어떤 prokaryotic 세포1,,23에서 발견. LD 코어 triglyceride (TG) 및 콜레스테롤 에스테 르와 같은 중립 지질으로 구성 된다. 그들은 또한 ceramides, 생리 활성 지질 세포 신호 통로4,5에 포함 되어 있습니다. LDs는 인지질 단층으로 둘러싸여 있으며 perilipin 단백질 perilipin 2 (PLIN2) 및 3 (PLIN3)1,,56을 포함 하 여 단백질 코팅. 또한 현재는 lipogenic 효소, lipases, 그리고 무 알콜 지방 간 질환, C 형 간염3,5, 알코올 간 질환 등 여러 가지 간장 steatotic 질병에 연결 된 멤브레인 밀매 단백질 ,6,,78,,910.
LDs는 응급실의 외부 막에서 형성 새로 합성된 안내 무료 지방산 응급실 파생11에서 공급을 포함 하 고 생각 된다. 그러나, 그것은 알 수 없는 남아 여부 풀링된 지질 버드, 연결, 유지 또는 ER6,11, LDs 기술적으로 도전적인 응급실에서의 절연을 만드는에서 excised. 무료 지방산 에너지 생산 또는 막 합성 제공할 수 표면 lipases의 행동에 의해 LDs에서 해방 될 수 있습니다. 또한, LDs 무료 지방산12를 생산 하 고 규제 메커니즘으로 lipophagy를 통해 메시지를 저하 수 있습니다.
ER와 리소좀, 다른 세포는-미토 콘 드리 아, endosomes, peroxisomes, 원형질 막 등-는 LDs11의 가까운 협회에서 찾을 수 있습니다. 이 꽉 일부 다 처 제는 순수한 LD 추출 하기 어려운 있습니다. 그러나, 중립 지질 타고 난 낮은 밀도 원심 분리5를 통해의 이점을 취할 수 있습니다.
전통적으로, LDs는 자당 밀도 그라데이션1,,513를 사용 하 여 격리 되었습니다. 그러나, 이러한 방법은 하지 다른 세포를 격리 하기 위해 설계 되었습니다. 또한, 그들은 시 약의 시간이 걸리는 준비가 필요합니다. 이 프로토콜 적응 상용 ER 격리 (참조 테이블의 재료) LD 격리 수 있도록 키트. LD 격리 단계 추가 추출 버퍼는 키트에 의해 제공 된 사용 합니다. 또한, 프로토콜 또한 응급실 및 lysosomal 격리 LDs의 라이프 사이클의 보다 포괄적인 이미지에 대 한 수 있도록 동일한 샘플을 사용 하 여 사용할 수 있습니다. 이 새로운 방법의 유효성을 검사 하려면 우리는 LD 생산량, 형태, 크기, 및 순도 분석 결과. 우리는 여기에 제시 된 LD 격리에 대 한 자당 기온 변화도 활용 하 여 널리 사용 되는 프로토콜을 얻은 그 결과 비교 합니다.
우리는 10-에 12 주 된 사용, 물에 자유 접근을 16 h (LD 격리 동안 오전 9 시 오후 5 시에 식품 제거) 20 g 여성 C57BL/6 마우스 금식. 안내에 대 한 일반적인 수익률 0.6 mg/g 간 이며 LD 단백질, 그것은 0.25 mg/g 간. 이 SDS 페이지 ~ 10 immunoblots에 대 한 충분 한 자료를 제공합니다. 아래의 프로토콜 사용 시 약 및 적합 한 단일 1 g 간 프로토콜을 자세히 설명 합니다. 자당 그라데이션 격리 프로토콜 사토14 와 우15에서 적응 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
간장 LD 생물학은 점점 건강 및 질병에 간세포 생리학의 중요 한 레 귤 레이 터로 인식 되 고 있습니다. 타고 난 세포로 LDs는 동적와 상호 작용 다른 세포 구조, 지질 및 포도 당 항상성에서 포함 된 그들 bioactive 구성 요소에서 포함. 자당 그라데이션 LD 격리 일상적으로 사용 하 고 LD 구조, 연구 조사를 가능 하 게 하지만 그것은 수많은 버퍼를 만들기 위해 그들을 요구 한다. 우리는 증명 하고있다 상…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 가족 암 Abramson 연구소 감사. 이 작품은 다음 교부 금에 의해 지원: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, 로버트 우드 존슨 재단, 해 롤 드 모스 의료 교수진 개발 상, 7158, IDOM DRC 조종사 상을 P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (제). 이 작품 일부 NIH P30-DK050306에 의해 지원 되었다 고 그 핵심 시설 (분자 병 리 및 이미징 코어, 분자 생물학/유전자 식 코어 및 셀 문화 코어)와 그 파일럿 프로그램을 부여 합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
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