Протокол изоляции капелька быстрого липидов используя налаженные органеллы изоляции комплект
Summary
Этот Протокол устанавливает новый метод изоляции капелька липидов и очистки от мыши печень, используя набор для изоляции устоявшихся эндоплазматического ретикулума.
Abstract
Липидного капель (LDs) являются биологически органеллы в цитозоле наиболее эукариот и некоторые прокариотических клеток. LDs состоят из нейтральных липиды, заключенная в монослое белков и фосфолипидов. Печеночная LD липиды, церамиды, и белки причастны несколько заболеваний, которые вызывают печеночная стеатоз. Хотя предыдущие методы были созданы для изоляции LD, они требуют длительной подготовки реагентов и не предназначены для изоляции несколько субцеллюлярные отсеков. Мы стремились создать новый протокол для включения изоляции LDs, эндоплазматический ретикулум (ER) и лизосом из одной мыши печени.
Кроме того, все реактивы, используемые в протоколе, представленные здесь являются коммерчески доступными и требуют минимальной реагент подготовки без ущерба для LD чистоты. Здесь мы представляем данные сравнения этот новый протокол к стандартным сахарозы градиента протокол, демонстрируя сопоставимых чистоты, морфология и урожайность. Кроме того мы может изолировать ER и лизосомы, с использованием того же образца, обеспечивая подробное понимание формирования и внутриклеточных потока липидов и их связанные белков.
Introduction
LDs являются биологически органеллы в цитозоле наиболее эукариотических клеток и2,некоторые прокариотических клеток в1,3. LD ядро состоит из нейтральные липиды как эфиры холестерина и триглицеридов (ТГ). Они также содержат Церамиды, биоактивных липиды, участвующих в клеточном сигнальных путей4,5. LDs окружены фосфолипидного монослоя и покрытием с белками, включая perilipin белки perilipin 2 (PLIN2) и 3 (PLIN3)1,5,6. Также присутствуют lipogenic ферменты, липазы и мембранных белков людьми, которые были связаны с несколькими steatotic заболеваниях печени, включая безалкогольного наварного заболевания печени, алкогольная болезнь печени и гепатит C3,5 ,6,,78,9,10.
Подуманы, что LDs от внешней мембраны ER и содержат заново синтезированные TG, получены из11ER-производные свободных жирных кислот. Однако, остается неизвестным, ли Объединенные липиды бутон, остаются подключенными, или вырезана из ER6,11, делает изоляцию LDs от технически сложных ER. Свободные жирные кислоты могут быть освобождены от LDs действием поверхности липазы для производства энергии или синтеза мембранных. Кроме того может снизиться LDs через lipophagy механизм регулирования, а также производить свободные жирные кислоты12.
Помимо ER и лизосомы, есть другие органеллы — например, митохондрии, endosomes, пероксисомы и плазматической мембраны — которые находятся в тесной взаимосвязи LDs11. Этот плотный полигамии делает его трудным для выполнения чисто LD добычи. Тем не менее нейтральные липиды врожденной низкой плотности могут быть приняты преимущество через центрифугирования5.
Традиционно LDs были изолированы с помощью сахарозы плотность градиента1,5,13. Однако эти методы не предназначены для изоляции другие органеллы. Кроме того они требуют длительной подготовки реагентов. Этот протокол адаптируется коммерчески доступных ER изоляции комплект (см. Таблицу материалов) для изоляции LD. Мы используем извлечения буфер, предоставленный набор, добавив LD изоляции шаг. Кроме того протокол может также использоваться для ER и лизосомальных изоляции с помощью же образцы, позволяющие более подробное изображение жизненного цикла LDs. Чтобы проверить этот новый метод, мы пробирного выход LD, морфология, размер и чистоты. Мы сравниваем результаты, представленные здесь для тех, кто получил с широко используемый протокол, используя градиент сахарозы для изоляции LD.
Мы использовали 10 к 12-week-old, 20 g, женский C57BL/6 мышь постился 16 h (удаление продовольствия в 5:00 вечера время изоляции LD 9.00) с свободный доступ к воде. Типичный выход для TG 0.6 мг/г печени, и LD белка, это 0,25 мг/г печени. Это обеспечивает достаточно материала для ~ 10 иммуноблотов, SDS-страницы. Протокол ниже подробности реагентов, используемых и протокол для одного 1 g печени. Протокол градиента изоляции сахарозы заимствован из Сато14 и15Ву.
Protocol
Representative Results
Discussion
Печеночная LD биологии все чаще признается как критический регулятор гепатоцеллюлярной физиологии в здоровье и болезни. Как bona fide органеллы LDs являются динамическими, взаимодействуют с другими клеточных структур и содержат в них биологически активных компонентов, вовлеченных в гомеос…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Абрамсон семьи рака научно-исследовательский институт. Эта работа поддерживается следующие гранты: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Роберта Вуда Джонсона Фонда, Гарольд Амос медицинский факультет премии в области развития, 7158, IDOM ДРК пилот премии Р30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Эта работа была поддержана в части NIH P30-DK050306 и его основной зал (молекулярной патологии и изображений ядра, молекулярной биологии/ген выражение ядра и ядро культуры клеток) и его пилот грантовой программы. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
