Bir Well-established organel izolasyon Kit kullanarak hızlı Lipid damlacık yalıtım Protokolü
Summary
Bu iletişim kuralı bir roman yöntemi lipid damlacık tecrit ve arıtma fare karaciğer, bir iyi kurulmuş endoplazmik retikulum izolasyon kit kullanarak üzerinden kurar.
Abstract
Lipid damlacıkları (LDs) biyoaktif organelleri en ökaryotik ve bazı prokaryotik hücreler sitozol içinde bulundu vardır. LDs nötr lipitler fosfolipitler ve proteinler monolayer ile kaplı oluşur. Seramidler ve proteinlerinin hepatik LD lipidler hepatik yağlanma neden çeşitli hastalıklarda karıştığı. Önceki yöntemler LD yalıtım için kurulmuş olsa da, onlar reaktifler zaman alıcı bir hazırlık gerektirir ve birden çok hücre altı bölmeleri yalıtım için tasarlanmamıştır. Yalıtım LDs, endoplazmik retikulum (ER) ve organellerin tek fare karaciğer üzerinden etkinleştirmek için yeni bir iletişim kuralı kurmak istedi.
Ayrıca, tüm reaktifler burada sunulan protokolünde kullanılan piyasada bulunan ve LD saflık ödün vermeden en az reaktif hazırlık gerektirir. Burada veri standart Sükroz degrade iletişim kuralı, bu yeni iletişim kuralına karşılaştırma karşılaştırılabilir saflık, morfoloji ve verim gösteren mevcut. Ayrıca, biz ER ve aynı örnek kullanarak organellerin oluşumu ve lipidler ve onların ilişkili proteinler hücre içi akı gösteren ayrıntılı bilgilere sağlayan ortadan kaldırabilirsiniz.
Introduction
LDs sitozol en ökaryotik hücre ve bazı prokaryotik hücreler1,2,3biyoaktif organelleri vardır. LD çekirdek Trigliserid (TG) ve kolesterol esterleri gibi nötr lipitler oluşur. Ayrıca Seramidler, biyoaktif lipidler hücresel sinyal yolları4,5‘ te yer alan içerirler. LDs Fosfolipid monolayer tarafından çevrili ve perilipin protein perilipin 2 (PLIN2) ve 3 (PLIN3)1,5,6dahil olmak üzere proteinler ile kaplı. Ayrıca lipogenic enzimler, lipaz ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı, alkolik karaciğer hastalığı ve hepatit C3,5 de dahil olmak üzere birkaç hepatik steatotic hastalıklar için bağlı membran kaçakçılığı proteinler mevcuttur ,6,7,8,9,10.
LDs acil servis dış membran form ve serbest yağ asitleri ER elde edilen11‘ den kaynaklı yeni sentezlenmiş TG içeren düşünülmektedir. Havuza alınan lipidler bud, ancak, bilinmeyen kalır bağlı kalan veya ER6,11yalıtım LDS teknik olarak zor ER ücretsiz yapma, güvenliğe. Serbest yağ asidi LDS’den enerji üretim veya membran sentezi için sağlamak için yüzey lipazlar eylem tarafından özgür olmak. Ayrıca, LDs lipophagy bir düzenleyici mekanizma olarak ve serbest yağ asitleri12üretmek için düşebilir.
ER ve organellerin yanı sıra, diğer organelleri vardır — mitokondri, endosomes, tanımladıkları ve plazma zarı gibi — LDs11yakın ilişki içinde bulunur. Bu sıkı çok eşlilik bir saf LD çekimi gerçekleştirmek zorlaştırır. Ancak, nötr lipitler doğuştan gelen düşük yoğunluklu Santrifüjü5üzerinden avantaj alınabilir.
Geleneksel olarak, LDs Sükroz yoğunluk gradient1,5,13kullanarak izole edilmiştir. Ancak, bu yöntemleri diğer organelleri yalıtmak için tasarlanmış değil. Ayrıca, onlar reaktifler zaman alıcı hazırlık gerektirir. Bu iletişim kuralı bir piyasada bulunan ER yalıtım adapte LD yalıtım için izin vermek için (bkz. Tablo reçetesi) kit. Biz paketi tarafından sağlanan ayıklama arabellek LD yalıtım adım ekleme kullanın. Ayrıca, protokol ER ve LDs yaşam döngüsünün daha kapsamlı bir resim için izin aynı örnekleri kullanarak lizozomal yalıtım için de kullanılabilir. Bu yeni yöntem doğrulamak için LD verim, Morfoloji, boyutu ve saflık tahlil. Biz burada sunulan bu LD yalıtım için Sükroz degrade kullanan yaygın olarak kullanılan bir iletişim kuralı ile elde edilen sonuçlar karşılaştırın.
Biz bir 10 – için 12-hafta-yaşlı kullanılan, su ücretsiz erişim ile 16 h (5 Açıkhava 9: sabah LD yalıtım kez gıda kaldırmayı) için 20 g kadın C57BL/6 fare oruç tuttum. TG için tipik verim 0.6 mg/g karaciğer için LD protein, 0.25 mg/g karaciğer mi var… Bu ~ 10 immunoblots tarafından SDS sayfası için yeterli malzeme sağlar. Ayrıntılar kullanılan reaktifler aşağıda Protokolü ve bir tek 1 g karaciğer için uygun bir protokol. Sükroz degrade yalıtım Protokolü Sato14 ve Wu15uyarlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hepatik LD Biyoloji giderek kritik bir regülatör hepatosellüler Fizyoloji sağlığı ve hastalıkları olarak kabul. Olarak iyi niyetli organelleri, LDs dinamiktir, diğer Hücresel yapıları ile etkileşim ve biyoaktif bileşenler lipid ve glukoz homeostazı yer onları içinde içerir. Sükroz degrade LD yalıtım için rutin olarak kullanılan ve Müfettişler LD yapısı çalışma sağlar, ancak çok sayıda arabellekleri yapmak onlara gerektirir. Biz piyasada bulunan bir ER izolasyon kit kullanımı tandem yal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Abramson aile Kanser Araştırma Enstitüsü teşekkür ediyoruz. Bu eser aşağıdaki hibe tarafından desteklenir: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Vakfı, Harold Amos Tıp Fakültesi geliştirme Ödülü, 7158, IDOM DRC Pilot Ödülü P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (JC). Bu eser kısmen NIH P30-DK050306 tarafından desteklendi ve çekirdek tesisleri (Moleküler Patoloji ve Imaging Core, moleküler biyoloji/gen ifade çekirdek ve hücre kültür Core) ve pilot program verin. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
