Purification de la Fraction dendritique filopodia-riche
Summary
Dans ce protocole, nous introduisons une méthode pour purifier la fraction dendritique filopodia-riche de la structure phagocytic de la coupe-comme la saillie sur les neurones hippocampiques cultivés en profitant de l’affinité spécifique et forte entre un filopodial dendritique la molécule d’adhérence, TLCN, et une molécule extracellulaire de matrice, vitronectin.
Abstract
La filodée dendritique sont des saillies minces et longues basées sur le filament d’actine, et elles s’étendent et se rétractent comme si la recherche d’un axone cible. Lorsque la filodée dendritique établir le contact avec un axone cible, ils commencent à mûrir dans les épines, conduisant à la formation d’une synapse. La télencéphale (TLCN) est abondamment localisée dans la filodée dendritique et est progressivement exclue des épines. La surexpression de TLCN dans les neurones hippocampiques cultivés induit la formation de filopodia dendritique. Nous avons montré que la téencéphale se lie fortement à une molécule de matrice extracellulaire, la vitronectin. Les microbilles vitronectin-enduites ont induit la formation phagocytic de tasse sur les dendrites neuronales. Dans la tasse phagocytique, TLCN, les protéines tlcN-contraignantes telles que l’Ezrin/Radixin/Moesin phosphorylé (phospho-ERM), et F-actine sont accumulées, ce qui suggère que les composants de la tasse phagocytique sont semblables à ceux de la filodasie dendritique. Ainsi, nous avons développé une méthode pour purifier la tasse phagocytique au lieu de filopodia dendritique. Des perles magnétiques de polystyrène ont été enduites avec la vitronectin, qui est abondamment présente dans le milieu de culture des neurones hippocampiques et qui induit la formation phagocytic de tasse sur les dendrites neuronales. Après 24 h d’incubation, les tasses phagocytiques ont été légèrement solubilisées avec le détergent et rassemblées utilisant un séparateur d’aimant. Après avoir lavé les perles, les protéines de liaison ont été élucées et analysées par la coloration argentée et le ballonnement occidental. Dans la fraction contraignante, Le TLCN et l’actine étaient très présents. En outre, beaucoup de protéines identifiées de la fraction ont été localisées à la filopodia dendritique ; ainsi, nous avons nommé la fraction de liaison comme la fraction dendritique filopodia-riche. Cet article décrit des détails concernant la méthode de purification pour la fraction dendritique filopodia-riche.
Introduction
La filodée dendritique sont considérées comme des précurseurs des épines. Les filaments d’actine dans la filopodia dendritique règlent leur extension et rétractation1,2,3. Après contact avec un axone, la filodée dendritique sélectionnée commence leur maturation dans les épines, et une synapse est formée4,5. Les composants des épines ont été déterminés à partir de l’analyse complète des fractions de densité postsynaptic6,7, tandis que les composants de la filodée dendritique restent largement inconnus. Il a été démontré que la télencéphaline (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 kinase, Akt, mTOR, polo-like kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, et EphB régulent la formation de filopodia dendritique5,8,9 ,10,11, alors qu’une méthode n’a pas été développée pour l’analyse complète des molécules présentes dans la filodée dendritique.
TLCN (ICAM-5) est spécifiquement exprimé par les neurones épineux dans le segment le plus rostral du cerveau, le telencephalon12. TLCN a 9 domaines Ig-like dans sa région extracellulaire, une région transmembrane, et une queue cytoplasmique13. TLCN lie à la vitronectin (VN) et LFA-1 integrin dans sa région extracellulaire, à la présénilin e dans sa région transmembrane, et à la phospho-ERM et à l’actinine dans sa région cytoplasmique5,8,14,15 ,16. TLCN se lie au cytosquelette d’actine par phospho-ERM aux extrémités de la filodée dendritique et de l’actinine dans les épines et les arbres dendritiques8,16.
Nous avons montré que la surexpression de TLCN a amélioré la formation de filopodia dendritique et a induit le retour des épines à la filopodia10. La forme active constitutive de l’ezrin lié à la région cytoplasmiquede TLCN et la formation améliorée de filopodia dendritique 8. Ainsi, TLCN régule la formation de filopodia dendritique par des protéines actin-contraignantes. Esselens et coll. ont démontré que les microbilles induisaient l’accumulation de TLCN sur les neurones cultivés17. Nous avons montré que les structures phagocytiques de tasse ont été formées sur les dendrites neuronales autour des microbilles VN-enduites dans une manière TLCN-dépendante15. Les constituants de la filodée dendritique sont semblables à ceux de la tasse phagocytique. Il est difficile de recueillir la filodée dendritique, mais il est relativement plus facile de recueillir la tasse phagocytique à l’aide de microbilles magnétiques. Ainsi, nous avons développé une méthode pour purifier la tasse phagocytique au lieu de filopodia dendritique18. Ici, nous décrivons la méthode de purification pour la fraction dendritique filopodia-riche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé une méthode de purification pour la fraction dendritique filopodia-riche en utilisant l’affinité entre la molécule d’adhérence cellulaire TLCN et la protéine extracellulaire de protéine vitronectin. Par rapport à la fraction DEP, il pourrait être possible d’identifier les protéines synaptiques agissant sur la synapse immature de la fraction dendritique filopodia-riche. Ainsi, les constituants de la fraction dendritique filopodia-riche sont différents de ceux de la fraction PSD par 74%. Di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Shigeo Okabe et Hitomi Matsuno pour la culture de faible densité des neurones hippocampiques, Masayoshi Mishina pour les souris déficientes TLCN, Sachiko Mitsui et Momoko Shiozaki pour l’assistance technique, et les membres du laboratoire Yoshihara pour des discussions utiles . Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant Nos. JP20700307, JP22700354, et JP24500392 et MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 à YF et JP20022046, JP18H04683, et JP18H05146 à YY.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
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