유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체의 성장과 특성화

Summary

마우스 유 방 땀 샘에서 개발 된 소기관을 조사 하 고 면역 세포와의 상피 특성과 상호 작용을 평가 하는 것을 특징으로 한다. 조사 된 유기 체는 조사 된 정상 조직에서 종양 세포 모집을 유도할 수 있는 세포-세포 상호작용을 더 잘 평가 하기 위해 사용 될 수 있다.

Abstract

소화 조직 으로부터 유래 된 오 르가 노이 드는 세포 단층 보다 생체 내 조건에서 더 잘 탈환 되는 다중 세포 3 차원 (3d) 구조 이다. 비록 그들은 완전히 생체의 복잡성을 모델링할 수 없습니다., 그들은 원래 장기의 일부 기능을 유지. 암 모델에서, 오 르가 노이 드는 일반적으로 종양 세포의 침략을 연구 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 정상 조직에서 방사선 반응을 평가 하기 위해 정상 및 조사 된 마우스 유선 조직에서 유기 체를 개발 하 고 특성화 하는 것을 목표로 합니다. 이러한 유기 oid는 방사선 조사 된 소기관과의 종양 세포 상호작용을 평가 하기 위해 미래의 시험관 내 암 연구에 적용 될 수 있다. 유 방 땀 샘은 절제 되었고, 20 Gy에 조사 되었으며, 콜라 게 나아 제 VIII 용액으로 소화 되었습니다. 상피 소기관은 원심 분화를 통해 분리 되었고, 3 차원 유기 체는 96-잘 저 접착 마이크로 플레이트에서 개발 되었다. 유기 oid는 특징적인 상피 마커 사이토 케 라틴 (14)을 발현 시켰다. 대 식 세포와 소기관 간의 상호작용은 공동 배양 실험에서 관찰 되었다. 이 모형은 종양 간 질 상호 작용, 면역 세포의 침 윤 및 조사 된 미세 환경 내에서의 대 식 세포 분극을 연구 하는 데 유용할 수 있습니다.

Introduction

삼중 음성 유방암 (TNBC)의 약 60% 환자는 치료¹의 한 형태로 서 유 방 보존 요법 (bct)을 선택 한다. 이러한 치료 양상에서, 유 방 조직의 일부를 포함 하는 종양은 제거 되 고, 주변 정상 조직은 잔류 종양 세포를 죽이기 위해 이온화 방사선에 노출 된다. 치료는 유방암 인구의 다량에 있는 재발을 감소 시킵니다; 그러나 TNBC를 사용한 치료 대상 환자의 약 13.5%가 locoregional 재발²를 경험 한다. 따라서, 방사선은 순환 종양 세포를 모집 할 수 있는 방법을 연구 (ctcs) 로컬 재발에 대 한 중요 한 통찰력으로 이어질 것입니다^3,4.

이전 작업에서는 정상 조직의 방사선이 다양 한 세포 유형⁵의 모집을 증가 시킨다는 것을 보여주었습니다. TNBC의 전 임상 모델에서 정상 조직에 대 한 대 식 세포 증가 및 후속 적 종양 세포의 조사는 정상 조직⁵에 관한 것 이다. 면역 상태는 조사 된 사이트에 종양 세포 모집에 영향을 미쳤다, 종양 세포 이....

Protocol

동물 연구는 밴 더 빌 트 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 제도적 지침 및 프로토콜에 따라 수행 되었습니다.

1. 쥐 및 세포 취득의 준비 (응 우 옌-옥 외¹¹)

1. 아 티 믹 Nu/Nu 마우스 (8-10 주)를 희생 하 여 자 궁 경부 탈 구가 이어지는 co2 질 식 사용. 70% 에탄올을 사용 하 여 피부를 청소 합니다.
2. 사전 멸 균 된가 위 및 집게를 사용 하 여 쥐에서 복 부 및 사 타 구니 유 방 동맥을 절제 하십시오. 절제술 전에 림프절을 제거 하십시오. 멸 균 된 1x 인산 완충 식 염 수가 (도 1a)로 헹 궈 냅니다.
3. Dulbecco의 변성이 글 미디어/영양 혼합물 10ML(DMEM/F12)를 사용 하 여 15 mL 튜브에 넣고 운반 하십시오. 샘플은 4°c에서 밤새 보관 하거나 즉시 처리 될 수 있다. 얼음을 계속.
4. 세 슘 소스를 사용 하 여 20gy에서 샘플을 조사 합니다 (그림 1b).
5. 조사 후 45 분이 지나면 유 방 땀 샘을 35 mm의 멸 균 셀 플....

Results

조사 된 상피 유선 유기 체는 마우스 유 방 땀 샘에서 성공적으로 장악 되 고, 처리 되 고, 저 접착 판에서 배양 되었습니다 (그림 1). 오 르가 노이 드 수율은 상이한 성장 환경에서 시 딩에 의해 시험 되었다 (도 2Ag). 10 cm 세포 판을 처리 한 조직 배양 물에 직접 세포를 파 종 하는 것은 섬유 아 세포의 자라 난을 산출 했습니다. 섬유 아 세포는 유기 체와 같은 초점의 동일 평면에 또는 가까운 상 대조 현미경에서 확인 되 고, 그들은 며칠 안에 도금 된 소기관에서 빨리 성장 했습니다. 섬유 아 세포의 성장 또한 지 하 막 및 콜라겐 단백질 매트릭스에서 소기관 될 때 관찰 되었다 (도 2e, F).

조사 된 소기관 성장을 최적화 하기 위해 다양 한 조건이 테스트 되었습니다 (그림 2h). 콜라 게 .......

Discussion

이 프로토콜에서, 우리는 조사 된 유 방 유기 체의 성장 및 특성화를 재현 하기 위한 방법을 개발 했습니다 (그림 1). 20gy의 조사 량은 종양 세포 모집⁵의 생체 내 모델 이전에 거울에 적용 되었다. 유 방 땀 샘의 조사는 생체 내 형성 이전에 면역 세포의 상응 하는 침 윤 없이 방사선 손상 효과의 분리를 허용 하였다. 시험관 내 조사 된 정상 조직 모델의 개발은 방사선 유도 CTC 모집^11,12에 기여할 수 있는 세포 상호작용의 실시간 시청을 가능 하 게 한다.

오 관 능 수율을 극대화 하기 위해 1.5-1.18 단계를 밀접 하 게 수행 하는 것이 중요 했습니다. 우리는 소화 용액에 농축 된 콜라 게 나아 제를 해 동 하는 것을 추가 했습니다. 농축 된 콜라 게 나아 제 분.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% 중성 완충 포르말린	VWR	16004-128
항시토케라틴 14	abcam	ab181595	로트: GR3200524-3
소 혈청 알부민	시그마	A1933-25G
콜라겐 유형 I	코닝	354236
클로스트리듐 히스톨리티쿰의 콜라겐 분해 효소, 유형 VIII	시그마	C2139
콜라겐 분해 효소 I	Gibco	17018029
DMEM / F12	Thermofisher	11320-033
DNAse	Roche	10104159001
DPBS	Fisher	14190250
E-Cadherin	세포 신호	전달 24E10	Lot : 13
FBS	Sigma	F0926
Gentamicin	Gibco	15750
염소 안티 토끼 보조	abcam	ab150077	green 로트: GR3203000-1
염소 안티 토끼 보조	abcam	ab150080	red 로트: GR3192711-1
Hoechst 33342	Fisher	62249	로트: TG2611041
인슐린(10mg/mL)	Sigma	i9278
인슐린-트랜스페린-셀레늄, 100x	Gibco	51500-056
Matrigel Basement Membrane (Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종에서 추출한 기저막)	Corning	356237
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates	Thermo	174927
PBS	VWR	10128-856
Pen/strep	Fisher
Phalloidin	abcam	ab176757	Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1	Novus	NBP1-85047	Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)	Sigma	X100-100ML
Trypsin	Gibco	27250-018
Tween-20 (폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트)	시그마	P1379-100ML