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방법 논문

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

13.6K 조회수

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DOI:

10.3791/59297

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2019년 4월 18일

 , 

이 논문에서

요약

우리는 이러한 keratinocytes 및 섬유 아 세포를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 keratinocytes 및 섬유 아 세포 분화 및 3D 피부 organoid, 생성 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜 humanized 마우스 모델을 생성 하는 추가 단계를 포함 합니다. 여기에 제시 된 기술 피부과 연구를 향상 됩니다.

초록

피부는 신체의 가장 큰 기관 이다 하 고 많은 기능을가지고 있다. 피부 물리적 장벽 및 시체의 수호자로 서 역할을 하며 신체 기능을 조절. Biomimetics 모델, 시스템 및 복잡 한 인간의 문제1을 해결 하기 위해 자연의 모방 이다. 피부 biomimetics 생체 외에서 질병 연구 그리고 vivo에서 재생 의학에 대 한 유용한 도구입니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 무제한 확산의 특성 있고 3 개의 세균 층을 차별화의 능력. 인간의 Ipsc는 다양 한 기본 세포, 혈액 세포, keratinocytes, 섬유 아 세포 등에서 생성 됩니다. 그 중, 탯 줄 혈액 단 세포 (CBMCs) 수용자 재생 의학의 관점에서 다른 셀 원으로 떠오르고 있다. 셀 뱅킹 시스템에 필수적 이다 인간 백혈구 항 원 (HLA) 입력 하기 때문에 CBMCs는 재생 의학에 유용 합니다. 우리 섬유 아 세포와 keratinocytes CBMC Ipsc의 차별화 및 3D 피부 organoid의 생성을 위한 메서드를 제공합니다. CBMC iPSC 파생 keratinocytes 및 섬유 아 세포 1 차 셀 라인에 유사한 특성이 있다. 3D 피부 organoids는 피부 층에 표 피 레이어 overlaying에 의해 생성 됩니다. 이 3D 피부 organoid, 이식으로 인간 답게 마우스 모델 생성 됩니다. 이 연구는 3 차원 인간의 iPSC 파생 피부 organoid 피부과 연구 생체 외에서 그리고 vivo에서 소설, 대체 도구가 될 수 있습니다 보여줍니다.

서론

피부는 신체의 가장 바깥쪽 표면 커버 하 고 내부 장기를 보호 한다. 피부는 병원 체에 대 한 보호, 흡수, 저장 물 등 다양 한 기능, 체온을 조절 하 고 신체를 검출 낭비2. 피부 이식 피부 소스;에 따라 분류 될 수 있다 다른 기증자 로부터 피부를 사용 하 여 이식 이식, 불린다 고 이식 환자 자신의 피부를 사용 하 여 autografts. autograft는 그것의 낮은 거부 위험으로 인해 선호 하는 치료, 피부 생 검은 심한 병 변 가진 환자 또는 피부 세포의 수가 부족에 수행 하기 어렵다. 환자에서 심한 화상, 피부 세포의 수 3 배 큰 부위를 커버 하는 데 필요한 있습니다. 환자의 몸에서 피부 세포의 제한 된 가용성 allogenous 식은 필요한 경우에 발생 합니다. 그것은 일반적으로 약 1 주3후 숙주의 면역 체계에 의해 거부 이후 자가 이식을 수행할 수 있습니다 때까지 일시적으로 이식 사용 됩니다. 환자의 면역 시스템에 의해 거부를 극복 하기 위해 이식 환자4같은 면역 정체성과 소스에서와 야 한다.

인간의 Ipsc는 줄기 세포 치료5셀의 신흥 소스입니다. ....

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프로토콜

동물 관련 된 모든 절차는 실험실 동물 복지 행위, 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 수행 했다 그리고 기관 동물 관리에서 지침 및 설치류 실험에 대 한 정책을 제공 하 고 한국 가톨릭 대학의 학부의 위원회 (IACUC)를 사용 합니다. 연구 프로토콜은 가톨릭 대학교의 한국 (CUMC-2018-0191-01)의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. Songeui 캠퍼스 2017 및 취득 협회 평가 대 한 식품 및 의약품 안전 청의 한국 우수 동물 실험실 시설 인가 IACUC, 가톨릭 대학교의 실험실 동물 (DOLA)의 부 고 2018 년에서 실험실 동물 케어 인터내셔널 (AAALAC) 국제 전체 인증 인가

1. 피부 세포 분화 유도 만능 줄기 세포에서

  1. 중간 준비
    참고: 어두운 환경에서 최대 3 개월까지 4 ° C에서 모든 매체를 저장 합니다. 살 균을 위해 사용 하기 전에 0.22 μ m polyethersulfone 필터 시스템을 사용 하 여 모든 매체를 필터링 합니다. 모든 매체의 500 mL 전체 볼륨에서 사용할 수 있었습니다.
    1. KDM1 준비 (keratinocyte 차별화 매체 1). 혼합 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) / 2% 태아....

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결과

피부는 표 피와 진 피, 대부분의 경우, 구성 됩니다. Keratinocytes는 주요 세포 유형의 표 피, 고 섬유 아 세포는 진 피의 주요 셀 형식. Keratinocyte 차별화의 체계는 그림 1에 표시 됩니다. CBMC iPCSc vitronectin 코팅 접시 (그림 1B)에 유지 되었다. 이 연구에서 우리가 EB 형성을 사용 하 여 섬유 아 세포와 keratinocytes CBMC Ipsc 분화. EBs는 교수형을 사용 하 여 생성 메서드 keratinocytes 및 섬유 아 세포 (그림 1C)의 균일 하 고 제어 차별화를 드롭. EBs 4 콜라겐 코팅 판 keratinocyte 차별화에 대 한 입력에 연결 된 그리고 매체 매일 변경 되었습니다. CBMC Ipsc RA,.......

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토론

인간의 Ipsc 맞춤된 재생 의료17에 대 한 새로운 대안 제안 되어 있다. 맞춤된 Ipsc 환자 파생 질병 모델링, 약물 검사, 및 자가 이식18,19사용할 수 있는 환자 특성을 반영 합니다. 환자 파생 Ipsc의 사용 또한 1 차 셀, 적절 한 셀 숫자 및 면역 반응5,,1719의 부족에 관한 문제를 극복할 수 있다. 그러나, 맞춤된 Ipsc의 경제적으로 실현 가능한 시간, 비용, 및 노동 제한 되지 않습니다. HLA homozygous CBMC 파생 Ipsc는 새로운 가능성으로 떠오르고 있다. HLA homozygous Ipsc 경제적으로 귀중 한 될 수 있으며 환자8<.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 건강, 복지 및 가족 업무, 한국 공화국 (H16C2177, H18C1178)에 대 한 한국 의료 기술 R & D 프로젝트, 정부에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아데닌시그마A2786섬유아세포에 대한 분화 배지의 구성
AggreWell 배지 (EB 형성 배지)STEMCELL05893EB 형성
항-피브로넥틴 항체abcam ab23750섬유아세포 마커
Anti-KRT14 항체abcam ab7800각질세포 마커
안티-로리크린 항체abcamab85679각질층 마커
Anti-p63 항체abcamab124762각질 세포 마커
Anti-Vimentin 항체Santa cruzsc-7558섬유 아세포 마커
BAND AID FLEXIBLE FABRICJohnson & Johnson-Bandage
기저막 매트릭스 (Matrigel)BD354277섬유아세포 분화 매체의 구성
BLACK SILK 봉합사AILEEESK617피부 이식
CaCl2SigmaC56703D 피부 오가노이드용 상피 배지의 구성
요소 콜라겐 I 유형 IBD 3542363D 피부 오가노이드
콜라겐 유형 IVSanta-cruzsc-29010각질 세포에 대한 분화 배지의 구성
요소 정의 된 각질 세포 - 세럼 프리 배지Gibco10744-019각질 세포
DMEM, 고 포도당Gibco11995065분화 배지의 구성
DMEM / F12 매체Gibco11330-032구성 요소 분화 매체
필수 8 매체GibcoA1517001iPSC 매체
FBS, 인증된Corning35-015-CV섬유아세포 및 각질세포를 위한 분화 매체의 구성
요소 Glutamax 보충제 Gibco35050061섬유아세포
인슐린Invtrogen12585-014대한 분화 배지의 구성 요소 섬유아세포 및 각질세포에 대한 분화 배지의 구성
요소 홍채 표준 곡선 가위ProfessionalPC-02.10수술 기구
각질 세포 무함유 배지Gibco17005-042분화 배지의 구성 요소 각질 세포
L-아스코르브산 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrateSigmaA8960각질 세포
MEM Non-essential Amino AcidGibco1140050섬유아세포에 대한 분화 배지의 구성
Meriam Forceps 엄지 손가락 16 cmHIROSEHC 2265-1수술 기구
NOD. CB17-Prkdc SCID/J잭슨 연구소001303피부 이식
페트리 접시 90 mm현대 마이크로H10090플라스틱 도자기
재조합 인간 BMP-4R & D314-BP에 대한 분화 배지의 구성
R & D236-EG케라티노사이트 레티노산을 위한 분화 매체의 구성
요소 SigmaR2625케라티노사이트
T/C Petridish 100 mm, 240/bxTPP93100플라스틱 웨어
TransferrinSigmaT37053D 피부 오르가노이드를 위한 상피 매체의 구성
요소 Transwell-COL 콜라겐 코팅된 막 삽입물& 주의;CorningCLS34923D 스킨 오가노이드용 플라스틱 제품 
VitronectinLife technologiesA14700iPSC 배양
Y-27632 Dihydrochloridepeprotech1293823iPSC 배양
요소 요소 요소 에 요소 각질 세포 재조합 인간 EGF 단백질 요소

참고문헌

  1. Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
  2. Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'etre" of the epiderm....

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