Immunohistochemistry, पश्चिमी विश्लेषण, और आरएनए अलगाव के लिए Drosophila प्यूपल रेटिना का विच्छेदन
Summary
इस कागज immunohistochemistry, पश्चिमी विश्लेषण, और आरएनए निष्कर्षण के लिए ऊतक के प्रसंस्करण के लिए प्रोटोकॉल के साथ साथ Drosophila प्यूपल retinas विदारक के लिए एक शल्य चिकित्सा पद्धति प्रस्तुत करता है ।
Abstract
ड्रोसोफिला प्यूपल रेटिना विकास के दौरान मॉरफोजेनेटिक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली प्रदान करता है । इस पत्र में, हम नाजुक Drosophila प्यूपल रेटिना के विच्छेदन के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हमारे शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण आसानी से उपलब्ध microdissection उपकरण का इस्तेमाल करने के लिए खुला प्यूपे और ठीक आंख मस्तिष्क परिसरों निकालने । ये तय किया जा सकता है, immunohistochemistry के अधीन है, और retinas तो माइक्रोस्कोप स्लाइड पर घुड़सवार और imaged अगर लक्ष्य सेलुलर या subcellular संरचनाओं का पता लगाने के लिए है । वैकल्पिक रूप से, अनिर्धारित retinas मस्तिष्क के ऊतकों से अलग किया जा सकता है, उचित बफ़र्स में लीजड ड और प्रोटीन जेल ट्रो या mrna निष्कर्षण के लिए उपयोग (प्रोटीन या जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए, क्रमशः) । महत्वपूर्ण अभ्यास और धैर्य का वर्णन microdissection प्रोटोकॉल मास्टर करने के लिए आवश्यक हो सकता है, लेकिन एक बार महारत हासिल है, प्रोटोकॉल मुख्य रूप से अक्षतिग्रस्त retinas के अपेक्षाकृत जल्दी अलगाव सक्षम बनाता है ।
Introduction
Drosophila रेटिना एक छत्ते जाली1,2,3,4में व्यवस्थित वर्णक कोशिकाओं से घिरा लगभग ७५० ommatidia से बना है । प्रत्येक नेत्रांशक में आठ फोटोरिसेप्टर ंयूरॉंस, चार लेंस स्राटिंग शंकु कोशिकाओं, और दो प्राथमिक वर्णक कोशिकाओं शामिल हैं । प्रत्येक नेत्रांशक आसपास वर्णक-जाली कोशिकाओं और संवेदी बाल खड़े समूहों का उत्पादन कर रहे हैं । अपनी पोस्ट-मिटिक प्रकृति और बाहुबली हेक्सागोनल व्यवस्था के कारण, ड्रोसोफिला प्यूपल रेटिना कोशिका आसंजन5,6सहित संरचनाविकासी प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली प्रदान करता है, 7,8,9,10 और अपोप्टोसिस11,12,13,14,15।
कई प्रकाशित प्रोटोकॉल हवा के दबाव का उपयोग करने के लिए आंख निकालने drosophila प्यूपा16,17,18से मस्तिष्क परिसरों । प्रोटोकॉल यहां वर्णित बजाय microdissection उपकरण का इस्तेमाल करने के लिए ध्यान से और ठीक आंख को अलग-अक्षतिग्रस्त रेटिना ऊतक प्राप्त करने के लक्ष्य के साथ मस्तिष्क परिसरों । यह महत्वपूर्ण है अगर retinas को morphological, प्रोटीन, या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा रहा है के बाद से रेटिना को नुकसान सेलुलर तनाव या मौत है, जो सेलुलर phenotype या जीन अभिव्यक्ति को संशोधित कर सकते में परिणाम हो सकता है । इसके अतिरिक्त, अभ्यास के बाद, 6 से 10 आंख मस्तिष्क परिसरों 10 से 15 मिनट में अलग किया जा सकता है, उम्र में परिवर्तनशीलता को ंयूनतम करने के लक्ष्य को सुविधाजनक बनाने और विच्छेद नेत्र ऊतक के विकासात्मक चरण ।
निर्धारण, immunostaining, और पूरे-माउंट प्रोटोकॉल नीचे वर्णित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए Drosophila आंखों की तैयारी के लिए उपयुक्त है । Retinas एंटीबॉडी के साथ इंयूबेटेड किया जा सकता है ब्याज के प्रोटीन लक्ष्यीकरण । उदाहरण के लिए, संधि घटकों का पालन करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग कोशिकाओं की अंतिम परिधि की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है ताकि कोशिका प्रकार, आकृति और व्यवस्थासहित विशेषताओं का मूल्यांकन किया जा सके । निर्धारण करने से पहले, आंखों के बजाय qRT-पीसीआर या आरएनए अनुक्रमण में उपयोग के लिए पश्चिमी विश्लेषण, या आरएनए के लिए प्रोटीन निकालने के उद्देश्य के लिए मस्तिष्क से cleaved किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila प्यूपल नेत्र विच्छेदन की विधि यहां वर्णित 10 से 15 मिनट के भीतर 6 से 10 नेत्र मस्तिष्क परिसरों के अलगाव के लिए अनुमति देता है । हालांकि, धैर्य और अभ्यास विच्छेदन तकनीक में महारत हासिल करने के लिए और व?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जैक ड्रम और पांडुलिपि पर सहायक टिप्पणियों के लिए हमारे समीक्षक धंयवाद । इस काम को R15GM114729 ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
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