등온선 적정 열 량 효소 안정성 측정

Summary

효소 활동의 열 안정성은 쉽게 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 측정 됩니다. 대부분 단백질 안정성 분석 실험은 현재 측정 단백질 전개, 사용 하지만 효소 활동에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. ITC의 효소 활동의 안정성에 효소 수정 효과의 직접 측정을 수 있습니다.

Abstract

이 작품에는 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 효소 활동의 안정성을 측정 하기 위한 새로운 방법을 보여 줍니다. 최대 열 속도 효소 솔루션으로 기판 솔루션의 단일 주사 효소 활동을 연관 후 관찰. 시간이 지남에 따라 동일한 효소 솔루션으로 기판의 여러 주사 효소 활동의 손실을 보여줍니다. 분석 결과, 아주 약간의 인사 시간을 요구 하는 자치 이며 대부분의 미디어와 효소에 적용 됩니다.

Introduction

효소는 단백질 catalyzing 다양 한 유기 반응의 수 있습니다. 중립 pH 가혹한 용 매를 사용 하 여 피할 근처에서 수성 해결책에서 대부분 효소 기능. 그들의 높은 선택도 때문에 효소 촉매 반응 적은 생산 (일부 경우에 아무 부산물) 산 및 기초¹등 선택적 비 촉매 보다 부산물. 이것은 특히 관련 식품 제조 최종 제품 인간의 소비를 위한 안전은 모든 화학 반응을 수행 해야 합니다 어디 에입니다. 현재, 효소는 높은 당 옥수수 시럽², 치즈³, 맥주⁴, 유 당-무료 우유⁵및 다른 중요 한 식품을 생산 하는 데 사용 됩니다. 이 종이 식품 산업에서 효소 사용에 초점을 맞추고, 하는 녹색 화학 및 의약품 합성에 포함 하는 효소에 대 한 다른 많은 사용이 있습니다.

효소의 유틸리티는 효소의 3 차원 구조를 유지에 따라 효소 활동의 안정성에 의해 제한 됩니다. 효소 구조 수정 PEGylation⁶, 동원 정지 고체 지원⁷,

Protocol

1. 샘플 준비

1. pH 4.6에서 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼의 1000 mL
   1. 졸업 하는 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL를 측정 합니다.
   2. 무수 나트륨 아세테이트의 8.2 g의 무게와 비 커에 추가.
   3. 비 커 저 어 접시에, 비 커로 저 어 막대를 배치, 저 어 접시에 돌려 놓고 완전히 녹아 때까지 저 어.
   4. 무수 나트륨 아세테이트는 완전히 해산, 보정 된 pH 미터를 가진 해결책의 pH를 측정 합니다.
   5. 원하는 pH 4.6를 1 M HCl 이나 NaOH 적절 하 게 추가 합니다.
   6. 때까지 총 볼륨은 1000 mL 증류수를 추가 합니다.
   7. 사용까지 실내 온도에 상점.
2. 효소 솔루션
   1. 효소 졸업 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼 pH 4.6 15 ml에서의 첫 번째 측정 8 mL에 의해 10-30 mg/mL 범위 내에서 솔루션 실린더의 10 mL를 준비 합니다.
   2. 효소와 함께 15 mL 원뿔 튜브에 버퍼 솔루션을 추가 하 고 효소 해산 했다 때까지 적극적으로 악수.
   3. 총 볼륨은 10 m....

Results

그림 1 및 그림 5 는 대표적인 결과 데이터 두 효소 lactase 및 당화를에서 보여줍니다. Lactase 및 당화 endothermically와 exothermically, 각각 두 개의 단으로는 당의 가수분해 촉매. 두 효소 반응 효소의 채도 배제 하는 농도에서 실행 되었습니다.

Lactase 데이터 ITC 데이터를 사용 하 여 효소 안정성을 추정 하는 방법을 보여 줍니다. 600 m m 유 당 (그림 1)의 4 개의 순차적 4 µ L 주사 20 mg/mL lactase로 적정 했다. 5400의 간격 각 주입 사이 s, 적용 하 고 각 주입 하기 전에 초기 기준선 돌아갈 충분 한 시간 수 있습니다. 위에서 설명한 프로토콜 25 ° C와 35 ° C, 45 ° C, 55 ° c.에서 수행 되었다 또한, 유 당 600.......

Discussion

여기에 설명 된 ITC 효소 안정성 분석 결과의 주요 이점은 자동화 이다. 일단 모든 적절 한 버퍼 및 솔루션은, 각 분석 결과 대 한 설정 시간 분석 결과 하 고 사람에 대 한 약 15 분입니다. 반면, 당화 및 lactase의 활동에 대 한 기존의 분석 하 고 분석 결과의 지속적인 참여와 함께 약 2 시간을 요구 하 고 많은 효소 활동 분석 실험을 상당히 더 많은 시간. 이전 발행물에서 우리는 당화 활동¹¹에 대 한 더 전통적인 spectrophotrometric 방법에 ITC 메서드에서 데이터를 비교 하는 방법을 증명 하고있다.

ITC는 분석 결과의 또 다른 장점은 거의 모든 효소¹²의 적용입니다. 따라서, 특정 조건에서 다른 효소의 안정성 테스트 여러 다른 분석 실험 설정이 필요 하지 않습니다. 또한, ITC 분석 결과 새로운 효소 또는 적합 한 색도계 분석 결과 효소의 활동의 안정성을 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-락토오스	피셔 사이언티픽	알 수 없음 (너무 오래된)	500g
나트륨 아세테이트, 무수 99% 분	Alfa Aesar	A13184-30	250g
락타제	MP Bio	100780	5g
하이드로콜릭 애씨드 솔루션, 1N	피셔 사이언티픽	SA48-500	500mL
벤치탑 미터- pH	VWR	89231-622
에탄올 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1갤런
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L(세척액)