Étudier les effets normaux du rayonnement tissulaire à l'aide d'hydrogels de matrice extracellulaire
Summary
Ce protocole présente une méthode pour la décellularisation et la formation suivante d’hydrogel des garnitures de graisse mammaire murine suivant l’irradiation ex vivo.
Abstract
La radiothérapie est une thérapie pour les patients atteints d’un cancer du sein triple négatif. L’effet du rayonnement sur la matrice extracellulaire (ECM) du tissu sain de sein et son rôle dans la répétition locale au site primaire de tumeur sont inconnus. Ici nous présentons une méthode pour la décellularisation, la lyophilisation, et la fabrication des hydrogels d’ECM dérivés des garnitures de graisse mammaire murine. Les résultats sont présentés sur l’efficacité du processus de décellularisation, et des paramètres rhéologiques ont été évalués. Les cellules de cancer du sein GFP- et luciferase-étiquetées encapsulées dans les hydrogels ont démontré une augmentation de la prolifération des hydrogels irradiés. Enfin, la coloration conjuguée de phalloidin a été employée pour visualiser l’organisation de cytosquelette des cellules encapsulées de tumeur. Notre objectif est de présenter une méthode de fabrication d’hydrogels pour l’étude in vitro qui imitent l’environnement in vivo des tissus mammaires et sa réponse au rayonnement afin d’étudier le comportement des cellules tumorales.
Introduction
Le cancer se caractérise par une prolifération excessive de cellules qui peuvent échapper à l’apoptose et métastasent également des sites éloignés1. Le cancer du sein est l’une des formes les plus courantes chez les femmes aux États-Unis, avec environ 266 000 nouveaux cas et 40 000 décès en 20182. Un sous-type particulièrement agressif et difficile à traiter est le cancer du sein triple négatif (TNBC), qui manque de récepteur d’oestrogène (ER), de récepteur de progestérone (PR), et de facteur de croissance épidermique humain (HER2). La radiothérapie est couramment utilisée dans le cancer du sein pour éliminer les cellules tumorales résiduelles après la tumorectomie, mais plus de 13% des patients de TNBC éprouvent toujours la répétition au site primaire de tumeur3.
On sait que la radiothérapie est efficace pour atténuer les métastes et les récidives parce que la combinaison de la tumorectomie et de la radiothérapie entraîne la même survie à long terme que la mastectomie4. Cependant, il a été récemment démontré que le traitement de rayonnement est associé à la répétition locale au site primaire de tumeur dans les arrangements immunocompromis5,6. En outre, il est bien connu que le rayonnement modifie la matrice extracellulaire (ECM) du tissu normal en induisant la fibrose7. Par conséquent, il est important de comprendre le rôle des changements induits par rayonnement DMC dans la dictée du comportement des cellules tumorales.
Les tissus décellularisés ont été utilisés comme modèles in vitro pour étudier la maladie8,9. Ces tissus décellularisés préservent la composition d’ECM et récapitulent le complexe in vivo ECM. Ce tissu décellularisé ECM peut être traité et digéré pour former des hydrogels ECM reconstitués qui peuvent être utilisés pour étudier la croissance cellulaire et la fonction10,11. Par exemple, les hydrogels injectables dérivés du lipoaspirate humain décellularisé et du tissu myocardique ont servi de méthodes non invasives d’ingénierie tissulaire, et un hydrogel dérivé du tissu pulmonaire porcin a été utilisé comme méthode in vitro de test l’attachement et la viabilité des cellules souches mésenchymales12,13,14. L’effet des dommages normaux de rayonnement de tissu sur des propriétés d’ECM, cependant, n’a pas été étudié.
Les hydrogels dérivés de l’ECM ont le plus grand potentiel d’étude in vitro des phénomènes in vivo. Plusieurs autres matériaux ont été étudiés, y compris le collagène, la fibrine et le matrigel, mais il est difficile de récapituler synthétiquement la composition de l’ECM13. Un avantage de l’utilisation d’hydrogels dérivés de l’ECM est que l’ECM contient les protéines et les facteurs de croissance nécessaires pour un tissu particulier14,15. L’irradiation du tissu normal pendant la tumorectomie provoque des changements significatifs à l’ECM, et les hydrogels ECM-dérivés peuvent être employés pour étudier cet effet in vitro. Cette méthode pourrait conduire à des modèles in vitro plus complexes et plus précis de la maladie.
Dans cette étude, nous avons soumis les coussinets de graisse mammaire murine (MFP) au rayonnement ex vivo. Les MFP ont été décellularisés et transformés en solution prégel. Les hydrogels ont été formés avec les cellules 4T1 incorporées, une ligne de cellules murine de TNBC. Les propriétés rhéologiques du matériel d’hydrogel ont été examinées, et la dynamique de cellules de tumeur ont été évaluées dans les hydrogels. Les hydrogels fabriqués à partir des MFPs irradiés ont amélioré la prolifération de cellules de tumeur. De futures études incorporeront d’autres types de cellules pour étudier les interactions cellules-cellules dans le contexte de la récidive du cancer après la thérapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode de formation d’hydrogel dépend en grande partie de la quantité de tissu de départ. Les MPF murines sont petits, et le processus de décellularisation entraîne une réduction significative du matériel (tableau 1). Le processus peut être répété avec plus de MFP pour augmenter le rendement final. Le fraisage est une autre étape importante qui peut entraîner la perte de matériel. D’autres ont montré le succès avec un moulin cryogénique, mais ce protocole est basé sur le fraisag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient la Dre Laura L. Bronsart d’avoir fourni les cellules GFP- et luciferase-4T1, le Dr Edward L. LaGory pour ses conseils sur 1-([Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol, le Dr Craig L. Duvall pour l’utilisation de l’IVIS et du lyophiliseur, et le Dr Scott A. Guelcher pour le rhéomètre utiliser. Cette recherche a été financée par les subventions des NIH #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |
References
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