細胞外マトリックスヒドロゲルを用いた正常組織放射線効果の研究
Summary
このプロトコルは、ex vivo照射後のマウス乳酸パッドの脱細胞化およびその後のヒドロゲル形成のための方法を提示する。
Abstract
放射線は、トリプルネガティブ乳癌患者のための療法です。健康な乳房組織の細胞外マトリックス(ECM)に対する放射線の影響と原発性腫瘍部位における局所再発におけるその役割は不明である。ここでは、マウスママリー脂肪パッドに由来するECMヒドロゲルの脱細胞化、凍結乾燥、および製造の方法を提示する。脱細胞化プロセスの有効性に関する結果が発表され、評価された。ヒドロゲルに封入されたGFP-およびルシフェラーゼ標識乳癌細胞は、照射ヒドロゲルにおける増殖の増加を示した。最後に、封入腫瘍細胞の細胞骨格組織を可視化するためにファロイジンコンジュゲート染色を用いた。我々の目標は、腫瘍細胞の挙動を研究するために、生体内乳房組織環境と放射線に対する応答を模倣するインビトロ研究のためのヒドロゲルを製造する方法を提示することである。
Introduction
癌は、アポトーシスを回避し、また遠方部位1に転移することができる細胞の過剰増殖によって特徴付げられる。乳癌は米国の女性の間で最も一般的な形態の1つであり、2018年には推定266,000人の新しい症例と40,000人の死亡が2018年2月に推定される。サブタイプを治療するのが特に積極的で困難なのは、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、およびヒト表皮成長因子(HER2)を欠いているトリプルネガティブ乳癌(TNBC)である。放射線療法は、腫瘍切除術後の残留腫瘍細胞を排除するために乳癌で一般的に使用されるが、TNBC患者の13%以上はまだ原発性腫瘍部位3で再発を経験する。
放射線療法は、腫瘍切除と放射線の組み合わせが乳房切除術と同じ長期生存をもたらすため、転移および再発を緩和するのに有効であることが知られている4。しかし、最近、放射線治療は、免疫不全の設定5、6における原発性腫瘍部位への局所再発と関連することが示されている。また、線維化7を誘導することにより、放射線が正常組織の細胞外マトリックス(ECM)を変化させるのもよく知られている。したがって、腫瘍細胞行動を指示する場合の放射線誘発ECM変化の役割を理解することが重要である。
脱細胞組織は、疾患8、9を研究するためにインビトロモデルとして使用されている。これらの脱細胞組織は、ECM組成物を保持し、生体内ECM中の複合体を再要約する。この脱細胞組織ECMは、細胞増殖および機能10、11の研究に使用することができる再構成されたECMヒドロゲルを形成するためにさらに処理および消化することができる。例えば、脱細胞化ヒト脂肪吸引および心筋組織由来の注射用ヒドロゲルは、組織工学の非侵襲的な方法として役立ち、ブタ肺組織に由来するヒドロゲルをインビトロ試験方法として利用した。間葉系幹細胞の付着および生存率12,13,14.しかし、ECM特性に対する正常組織放射線損傷の影響は調査されていない。
ECMに由来するヒドロゲルは、インビボ現象のインビトロ研究の最大の可能性を秘めています。コラーゲン、フィブリン、マトリゲルを含むいくつかの他の材料が研究されているが、ECM13の組成を総合的に要約することは困難である。ECM由来ヒドロゲルを使用する利点は、ECMが特定の組織14、15に必要なタンパク質および成長因子を含むことです。腫瘍切除の間に正常組織の照射はECMに重大な変化を引き起こし、ECM由来のヒドロゲルはインビトロでこの効果を研究するために使用することができる。この方法は、疾患のインビトロモデルにおいてより複雑で正確になる可能性がある。
本研究では、マウス乳腺脂肪パッド(MMF)を放射線ex vivoに供した。MMFを脱細胞化し、プレゲル溶液にした。ヒドロゲルは、埋め込まれた4T1細胞、マウスTNBC細胞株で形成された。ヒドロゲル材料の再生特性を調べ、ヒドロゲル内で腫瘍細胞ダイナミクスを評価した。照射されたMMFから製造されたヒドロゲルは腫瘍細胞増殖を増強した。今後の研究では、治療後の癌再発の文脈で細胞細胞相互作用を研究するために他の細胞型を組み込む予定です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒドロゲル形成のこの方法は、開始組織の量に大きく依存する。マウスMGPは小さく、脱細胞化プロセスは材料の大幅な減少をもたらす(表1)。プロセスは、最終的な収率を高めるために、より多くの複合機で繰り返すことができます。フライス加工は、材料の損失につながる可能性のあるもう一つの重要なステップです。他の人は低温ミルで成功を示していますが、このプロトコ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、GFPおよびルシフェラーゼ-4T1細胞を提供したローラ・L・ブロンサート博士に感謝し、エドワード・L・ラゴリー博士は1-([4-(ザイラゾ)xylyl]アゾ)-2-ナフトール染色、IVISおよび凍結性細胞使用のためのクレイグ・L・デュバル博士にアドバイスを提供した。使用。この研究は、NIH助成金#R00CA201304によって財政的に支援されました。
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |
References
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